大柴胡汤对慢性胰腺炎小鼠胰腺组织病理学改变的影响 HE染色显示： DBTC尾静脉注射1w可见胰腺明显呈急性炎症的表现；2w胰腺小叶水肿，可见腺泡细胞点片状坏死及炎细胞浸润；随着造模时间的延长，胰腺结构破坏更加明显，至4w可见纤维组织沉积，8w时胰腺纤维化明显，取代了正常的胰腺腺泡细胞及胰岛。经大柴胡汤灌胃治疗后，与同时间点模型组相比，胰腺损伤明显减轻；至8w仅有少量纤维组织沉积。 Alectinib数据表 胶原纤维（Masson）染色显示DBTC尾静脉注射后现少量蓝染的胶原纤维在间质中出现；随着造模时间的延长纤维化明显增加，至8w可见大量胶原纤维广泛增生，胰腺组织被纤维严重分割。大柴胡汤灌胃治疗后各时间点胰腺纤维化的程度明显减轻。

2．大柴胡汤对慢性胰腺炎小鼠血清AMS、HA、胰腺MMP/TIMP及MAPK通路的影响 DBTC尾静脉注射联合饮用乙醇后，血清AMS的活性明显升高；造模后2w、4w，血清AMS维持在较高水平，8w血清AMS水平显著降低，与对照组相比差异有显著性（P<0.01）；大柴胡汤治疗组1w、2w、4w血清AMS活性明显下降,与相应时间点模型组相比有显著性差异(P<0.01)，而8w血清淀粉酶活性没有出现明显下降，与模型组相比有所升高，差异存在显著性（P<0.01）。DBTC尾静脉注射联合饮用乙醇2周、4周后，血清HA明显升高,8周后进一步升高，与对照组相比有显著性差异（P<0.01）；大柴胡汤治疗组血清HA明显降低,与相应时间点模型组比较存在显著性差异(P<0.05)。而胰腺组织TIMP-1mRNA表达在造模2w时明显升高，4w、8w表达有所下降，但仍处于较高水平。大柴胡汤灌胃治疗后，2w、4w胰腺组织TIMP-1mRNA的表达降低，与模型组比较，具有明显差异（P
慢性疼痛是指由组织损伤,包括物理创伤、各类炎症以及自身免疫等原因引起的持续性疼痛,常表现为包括损伤部位及其投射区在内的广泛区域的疼痛、痛觉敏感和感觉异常。疼痛信号被外周感受器感受通过痛觉传导通路最终投射到皮层相关区域产生痛觉。慢性疼痛的发生主要是由于受到反复伤害性刺激使痛觉传导通路上神经元功能改变,包括神经元的异位放电、神经递质的大量释放和突触长时程增强等。然而,大量的证据提示疼痛尤其是慢性疼痛的产生不只是与神经元的活动有关,神经系统的另一类细胞-神经胶质细胞也发挥了重要作用,而神经元的功能改变与神经胶质细胞的活化密切相关。

中枢神经系统主要由神经元和各类胶质细胞组成,且胶质细胞的数量远大于神经元。传统理论认为,胶质细胞主要起支持、保护、营养和免疫等作用。即神经元是神经系统内参与神经功能活动的主体细胞。胶质细胞只对维持神经元的各项活动起支持作用。但是,随着对胶质细胞研究的不断加深,越来越多的资料表明,胶质细胞不仅仅是参与神经系统的生理或病理活动,而是在其中发挥了重要作用。 查找更多 在中枢神经系统中,神经胶质细胞主要包括星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞,其中小胶质细胞被认为是神经系统内的免疫细胞,参与神经系统的修复、免疫活动和炎症反应。近几年的研究发现,小胶质细胞的激活与各类神经、精神疾病,如神经退行性疾病PD、AD和抑郁症等密切相关。此外,研究还发现脊髓小胶质细胞与慢性疼痛的发生密切相关。在痛信号产生的初始阶段,就伴随有小胶质细胞的活化,包括明显的形态结构变化以及各种细胞因子(TNF-α、IL-1β、BDNF)的释放、活性氧自由基的生成等等。这些物质会作用于神经元并影响其功能,其结果是强化痛信号的产生和传递。虽然大量证据表明活化的胶质细胞参与了疼痛信号的传递,但是胶质细胞如何被活化目前并不十分明确。由于神经元与胶质细胞同属一个神经网络,常规的疼痛研究实验体系(围绕神经元设计的实验体系)无法区分痛刺激对神经元及神经胶质细胞的单一效应,大大限制了对胶质细胞活化尤其是活化机制的了解。此外,由于痛信号主要是由各种神经递质传递,因此有必要观察神经递质对脊髓胶质细胞的活化作用及相关机制。

传递伤害性信息进入脊髓的神经递质有ATP、谷氨酸、P物质和CGRP等。已有实验显示,ATP可通过小胶质细胞上的P2X4受体激活小胶质细胞,并且参与慢性疼痛的形成,而其它神经递质对脊髓小胶质细胞的活化及活化机制并不明确。P物质被认为是痛相关甚至是痛特异的神经递质,P物质属于肽类神经递质,介导外周伤害性信号由外周传入脊髓并参与脊髓内痛觉调制,其受体为NK-1受体。脊髓的小胶质细胞也表达有NK1受体,但是P物质对小胶质细胞的作用,如是否会直接刺激活化小胶质细胞,通过何种通路活化,以及其是否参与慢性疼痛目前尚不清楚。 基于目前关于胶质细胞在疼痛过程中发挥作用的实验设计的局限性,我们采用了离体培养的胶质细胞,直接观察相关的生物活性物质如P物质等对胶质细胞的作用并分析其信号通路,同时设计在体实验即将活化的胶质细胞注入脊髓蛛网膜下腔观察其对脊髓水平痛信号产生的影响。希望通过离体和在体的实验观察提供P物质通过活化脊髓小胶质细胞参与疼痛的确切证据。 目的： 1、通过离体培养脊髓小胶质细胞观察P物质对小胶质细胞的活化作用,包括细胞形态学观察和对TNF-α、IL-β释放量的检测。 2、通过P物质作用于离体培养的脊髓小胶质细胞,观察小胶质细胞胞内信号分子的变化。 3、利用痛行为检测的方法观察经P物质刺激活化的小胶质细胞对动物痛行为的影响。方法： 1、取出生24h以内的SD大鼠脊髓原代培养脊髓小胶质细胞。将培养的小胶质细胞分为4组：(1)空白对照组,细胞孵育全培液；(2)P物质200μM组；(3)P物质400μM组；(4)P物质800μM组；各组细胞分别孵育2h、6h、12h、24h后进行后续实验。 Gefitinib溶解度 2、采用免疫细胞化学法鉴定OX-42阳性的小胶质细胞,并观察P物质孵育后小胶质细胞的形态改变。 3、采用ELISA的方法检测P物质孵育后小胶质细胞对TNF-α和IL-p的释放情况。 4、利用激光共聚焦显微镜胞内钙离子成像技术观察P物质孵育后小胶质细胞胞内Ca2+浓度变化。 5、采用免疫荧光双标的方法观察P物质孵育后小胶质细胞胞内p38MAPK的磷酸化水平。 6、将体外P物质预先孵育的原代小胶质细胞鞘内注射至SD大鼠腰膨大部位蛛网膜下腔,测定注射前、注射后6h、12h、24h大鼠的痛行为改变,以缩足反射潜伏期(PWL)为指标,观察P物质活化的小胶质细胞对大鼠痛行为的影响。结果： 1、经OX-42免疫细胞化学方法鉴定,培养细胞为小胶质细胞,DAPI复染,证实细胞纯度达95%以上。 2、以全培液为空白对照,P物质200gM孵育后,细胞形态与空白对照几乎没有差别。P物质400μM组细胞胞体变大变圆,细胞形态保持完整,随观察时间延长,OX-42免疫染色增强。P物质800μM组细胞OX-42免疫染色增强,但多数细胞形态并不完整。 3、TNF-a的检测结果显示,P物质200μM组在4个时间点与空白对照组相比,均无统计学差异。P物质400μM和800μM组从6小时开始,TNF-α释放量明显增加(分别为276.63±15.3和447.57±19.36),12h达到高峰(分别为445.45±30.27和759.38±47.