实时定量PCR (real-time PCR)检测 定量称取冻存组织,Trizol法提取总RNA,经过逆转录后以18S为内参检测SAA1的表达,以确定SAA1高表达慢病毒的转染效果。
8.免疫荧光染色 重组SAA1蛋白刺激平滑肌细胞后,免疫荧光法检测胶原I、胶原III、MMP1和MMP8的表达。 9.统计学分析所有数值均以均数±标准差表示。对数据进行正态分布检验,正态分布的计数资料应用Student t检验,多组采用方差分析(ANOVA),非正态分布的资料行Mann-Whitney检验。设P0.05)。表明SAA1高表达慢病毒的局部转染,没有影响小鼠体内整体的脂质代谢。 2. plenti6.3-SAA1-IRES-EGFP慢病毒转染对血清SAA1及其他炎症因子表达的影响 Control组、lenti-null组、1ow-lenti-SAA1组的血清SAA1表达几乎没有变化,high-lenti-SAA1组的血清SAA1表达略高于前三组,但尚未达到统计学差异(P>0.05)；这四个组的炎症因子TNF-α、IL-6在血清中的分泌表达也未达到统计学差异(P>0.05)。表明慢病毒的局部转染,没有引起小鼠体内显著的炎症反应。 所以 3. plenti6.3-SAA1-IRES-EGFP;慢病毒转染后SAA1在颈动脉斑块内表达的检测 SAA1的免疫组化结果显示, control组和lenti-null组的阳性染色面积无差异(P>0.05), low-lenti-SAA1组和high-lenti-SAA1组的SAA1阳性染色区域显著高于lenti-null组及control组(P0.05), 点击此处 low-lenti-SAA1组和high-lenti-SAA1组的SAA1表达量显著高于lenti-null组及control组(P<0.05)；同时,high-lenti-SAA1组与low-lenti-SAA1组相比,脂质含量也显著增加(P0.05); low-lenti-SAA1组巨噬细胞的比例显著增加(P0.05)。这一结果表明,两个浓度梯度的SAA1高表达慢病毒转染均能显著增加颈动脉斑块内巨噬细胞的聚集。
6.SAA1高表达慢病毒转染对颈动脉斑块内平滑肌细胞的影响 对小鼠颈动脉斑块冰冻切片进行平滑肌细胞染色,四组之间的平滑肌细胞聚集未见显著改变,尽管两个浓度梯度的SAA1高表达慢病毒转染有轻微地增加颈动脉斑块内平滑肌细胞聚集的趋势,但未达到统计学差异。这一结果表明,SAA1高表达慢病毒转染不能改变斑块内平滑肌细胞的聚集。 7.SAA1高表达慢病毒转染对颈动脉斑块内胶原表达的影响 通过对小鼠颈动脉斑块冰冻切片进行masson染色,发现与control组相比,lenti-null组胶原未见显著改变(P>0.05); low-lenti-SAA1组胶原的比例显著增加(P0.05); high-lenti-SAA1组与low-lenti-SAA1组相比,胶原的比例显著减少,达到统计学差异(P0.05)；low-lenti-SAA1组易损指数显著减低(P0.05)。这一结果表明,低浓度的SAA1高表达慢病毒转染能显著降低斑块的易损性,但高浓度SAA1高表达慢病毒转染则显著增加斑块的易损性。 Akt抑制剂 9.SAA1诱导胶原Ⅰ和胶原Ⅲ表达 对小鼠颈动脉冰冻切片进行胶原Ⅰ的免疫组化染色发现,与control组相比,lenti-null组胶原Ⅰ的百分比未见显著改变(P>0.05); low-lenti-SAA1组胶原Ⅰ显著提高(P0.05); high-lenti-SAA1组与low-lenti-SAA1组相比,胶原Ⅰ显著减少达到统计学差异(P0.05);
low-lenti-SAA1组胶原Ⅲ显著提高(P<0.05)；high-lenti-SAA1组胶原Ⅲ显著减少(P0.05); p-ERK1/2的表达均随时间的延长发生改变,刺激可使p-ERK1/2显著上调。然后分别应用JNK、ERK1/2以及p38MAPK的特异性抑制剂预处理平滑肌细胞,这三种抑制剂均未能显著抑制SAA1诱导的胶原Ⅰ和胶原Ⅲ表达上调。上述结果充分说明了JNK、p38MAPK两条信号通路在平滑肌细胞内几乎未被SAA1激活,因此不参与下游的胶原Ⅰ和胶原Ⅲ表达的调控；而ERK1/2信号通路虽然能被SAA1激活,但却没有参与SAA1对胶原Ⅰ和胶原Ⅲ表达的调控。 11. Smad2/3信号通路介导SAA1诱导的胶原Ⅰ和胶原Ⅲ表达上调 经过不同时间的SAA1刺激后,p-Smad2和p-Smad3的表达均发生显著改变(P0.05)；接着经过TGF-β1的siRNA及其特异性抑制剂SB431542干预后,SAA1诱导的胶原I和胶原III表达上调仍没有改变。这些结果充分证明SAA1诱导胶原I和胶原Ⅲ表达上调的过程不依赖于TGF-β1。 13.SAA1通过增加MMP-2、MMP-8及MMP-9表达促进胶原降解 对小鼠颈动脉斑块冰冻切片进行免疫组化染色,MMP1在四组未见统计学差异(P>0.05)。MMP8结果表明,lenti-null组、low-lenti-SAA1组与control组相比,MMP8占斑块面积的百分比未见显著改变(P>0.05); high-lenti-SAA1组MMP8占斑块面积的百分比显著升高(P0.05);1μg/ml的浓度也无法显著增加MMP8的表达,但10μg/ml的浓度则显著增强MMP8的表达。Western blot结果显示,SAA1刺激后,MMP1的表达无显著改变(P>0.