伊马替尼和小檗碱联合作用于敏感K562、BaF3-P210和耐药的BaF3-P210-T315I,实验显示,小檗碱可以增加K562、BaF3-P210对伊马替尼敏感性和克服BaF3-P210-T315I细胞对伊马替尼的耐药性性。同时还检测了小檗碱对耐药细胞细胞集落能力(colony)的影响,结果显示,小檗碱可以有效抑制耐药株BaF3-P210-T315I细胞的集落形成,而ImatiVEGFR抑制剂nib不能显著抑制BaF3-P210-T315I细胞的集落形成;小檗碱也可以有效抑制BaF3-P210细胞的集落形成。进一步研究发现,小檗碱显著降低BaF3-P210-T315I和BaF3-P210细胞系中的BCR-ABL蛋白水平,而对BCR-ABL的mRNA水平无显著改变,因而可以认为小檗碱降解BCR-ABL融合蛋白。最后,为了探索小檗碱降解BCR-AB时间L蛋白的机制,我们检测了小檗碱处理细胞中的自噬现象和泛素化水平。结果显示,小檗碱处理后细胞中没有发生自噬现象,而在小檗碱处理BaF3-P210细胞,发现小檗碱可以增加细胞的泛素化水平。进而采用针对BCR-ABL免疫沉淀(IP),使用泛素抗体Western blot检测发现BCR-ABL蛋白发生了泛素化。采用Studio 4.1软件对小檗碱与BCR-ABL蛋不要白进行分子对接模拟,结果显示BCR-ABL共有3部位(SH2区域、蛋白激酶区域和F-肌动蛋白连接区域)可以与小檗碱蛋白分子对接,并在对接处序列发现赖氨酸,提示泛素化位点的存在。因此,小檗碱通过泛素化的机制降解BCR-ABL蛋白进而克服CML的耐药性。小檗碱有可能作为耐药CML的潜在靶向治疗药物。同时,也为中药现代化提供可能的实验依据。
目的:克隆出人Aurora B基因,并将其于大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株中表达,获得重组蛋白。