免疫组化和TUNEL实验 免疫组化和TUNEL实验用来分析双向PI3K/mTOR抑制剂联合辐射对肿瘤组织通路各蛋白变化的影响。免疫组化标本来源于5-8F小鼠移植瘤模型,组织切片厚度5mm。组织切片先在4%多聚甲醛中固定过夜,再用石蜡包埋。脱蜡和水化后,切片加入含有10mM柠檬酸钠缓冲液中,置于微波炉中20分钟,进行抗原修复。然后,组织切片用一抗4℃孵育过夜,再加入二抗室温下孵育1小时。最后用苏木素和染色,并在显微镜下观察及拍照。每张切片至少观察3个随机视野。TUNEL实验参照Promega公司的凋亡检测试剂盒说明书进行。 查找协议 10.统计学分析 本实验中所有的数据均采用均数±标准差表示,每个实验至少重复3次。均数间比较采用双侧t检验(two-tailed unpaired student’s t-test)或完全随机设计资料的方差分析(one-way

ANOVA)。在体内实验中,研究药物与辐射的协同抗肿瘤效应,采用析因分析。P<0.001,PPKI+RT<0.001；5-8F:PGSK+RT<0.05)或PKI-587(P
近10年来，肺癌已经逐渐从“one fits all”的治疗模式过渡到以分子标志为指导的个体化治疗，其中驱动基因为分子标志的靶向治疗有了更为显著的进展。EGFR （Epidermal growth factor receptor）、 EML4-ALK （Echinodermmicrotubule-associated protein-like4and anplastic lymphoma kinase）、 KRAS（v-Ki-ras2Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog）是肺腺癌最重要的三个驱动基因。第一个以驱动基因为靶点的成功范例是EGFR TKIs（Tyrosine kinaseinhibitor）治疗EGFR突变患者的有效率达70%，疾病无进展生存期（progression-free survival，PFS）也显著延长，使得肺癌的治疗模式发生了革命性的改变，第二个成功的范例是克唑替尼治疗ALK阳性患者的有效率约60%，2年生存率达50%，也显著优于传统的化疗疗效。

研究已证实EGFR突变是EGFR TKIs疗效和PFS最强的预测因素，但EGFR突变是否为非小细胞肺癌患者的预后预测因子仍存在争议。EML4-ALK是一个新的驱动基因，它与患者临床病理特征的研究结果并不一致，原因有各研究采用的方法不同、研究人群不同、样本量不够大，有的研究人群经过筛选等，在大样本随机患者中筛查EML4-ALK重排的研究很少，尤其是在中国肺腺癌患者中的研究更为少见，此外，探讨ALK重排在肺癌患者的预后意义的研究也很少报告。EML4-ALK融合基因的检测方法有三种，荧光原位杂交（Fluorescence 因为 in situhybridization，FISH）、免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）、逆转录聚合酶链反应（Reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR），三种方法各有优缺点，在大样本患者中比较三种方法的研究较少。KRAS是最早发现的驱动基因，尚无理想的靶向药物，KRAS对预后的预测价值也存争议。 针对以上的问题，我们设计在大样本随机肺腺癌患者中筛查EGFR、EML4-ALK、KRAS三个驱动基因，探讨三个基因与肺腺癌患者的临床特征、治疗疗效及预后的关系，并探讨FISH、Ventana IHC、RT-PCR方法检测ALK重排的作用，对临床个体化治疗具有非常重要的指导意义。 包括三部分内容： 第一部分：检测430例肺腺癌患者的EGFR基因状态，分析EGFR状态与临床病理特征、治疗疗效及预后的关系。430例患者中，186例（43.3%）患者携带EGFR突变；女性EGFR突变高于男性，不吸烟患者高于吸烟患者；三种主要腺癌亚型中，乳头状为主型EGFR突变率高于腺泡样为主型和实体型为主腺癌；EGFR状态与化疗疗效无关，EGFR突变是EGFR

TKI（sTyrosine kinase inhibitors）疗效的预测因子；多因素分析显示EGFR突变是预后独立因素，EGFR突变患者预后优于野生型患者。 第二部分：检测430例肺腺癌患者的ALK重排状态，分析ALK重排与临床病理特征、治疗疗效及预后的关系，并评价FISH、Ventana Selleck Natural产品 Library IHC及RT-PCR三种方法检测ALK重排的作用。430例患者中，ALK阳性率为10.7%，年轻患者中多见，实体型为主腺癌和腺泡样为主型多见，EGFR野生型患者中多见。ALK重排与性别、吸烟状态、分期无关。ALK阳性患者对EGFR TKIs无效，ALK状态与化疗疗效及预后无关。采用FISH和Ventana IHC检测430例患者ALK状态，采用FISH、Ventana IHC和RT-PCR检测200例患者，Ventana IHC和FISH一致性好，敏感性和特异性分别为100%、98.2%，与FISH一致性为98.4%。RT-PCR的敏感性和特异性分别为95.7%、87.0%，与FISH的一致性为89.0%。三种方法检测结果显示RT-PCR敏感性更高。 第三部分：检测332例肺腺癌患者的KRAS状态，分析KRAS基因状态与临床病理特征、治疗疗效及预后的关系。332例患者中，24例（7.2%）携带KRAS突变，吸烟患者KRAS突变率高于不吸烟患者。KRAS不能作为判断TKI疗效、化疗疗效及预后的预测因子。332例肺腺癌患者EGFR、ALK、KRAS的频率分别为44.9%、9.6%、7.2%，肺腺癌患者三种基因的异常共计60.