05),和C组相比各T组GSK-3β蛋白磷酸化水平显著升高(P0.05),和T组相比GSK-3β蛋白磷酸化水平显著降低(P
糖原合酶激酶-3β(Glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β),是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,它参与调节细胞的多种生命活动,如增殖、分化、凋亡、粘附和细胞因子活性等。新近研究发现GSK-3β还参与了信号通路TNF-α-NF-κB的调控。例如GSK-3β基因敲除小鼠会出现严重炎症反应缺陷和肝细胞发育障碍,致使其胚胎期死于大量肝细胞凋亡,类似肿瘤坏死因子受体(Tumor necrosis factor 还有 receptor, TNFR)敲除或核因子-κB(Nuclear factor-κB, NF-κB)亚基p65敲除小鼠表型;同时该基因敲除小鼠的胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts, MEF)亦对肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α, TNF-α)、脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)等多种炎症因子有严重反应缺陷,导致TNF-α-NF-κB信号通路不能激活。 已知在70%肝切除术所造成的大鼠肝再生模型中TNF-α-NF-κB信号通路于肝切后数h迅速激活,随后启动多种重要基因如IL-6、iNOS、MMPs、cyclinD1等表达,从而对保护肝细胞抵抗细胞凋亡,促进细胞周期进程具有关键性作用。许多文献表明,一旦TNF-α-IKK-IκB-NF-κB信号通路上任一环节受阻,肝细胞对TNF-α诱导的凋亡作用尤其敏感,肝细胞再生进程将受严重影响。
考虑到GSK-3β能参与多种重要的细胞生命活动,而同时目前文献中关于GSK-3β在肝再生过程中的调控作用尚无报道,因此本课题旨在证明以下几个问题:1、GSK-3β在肝再生过程是否以及如何变化;2、抑制GSK-3β活性是否影响肝再生;3、如果GSK-3β对肝再生过程具有一定调控作用,其机制是什么,是否与TNF-α-NF-κB信号通路有关。 因此我们采用肝切前0.5h静脉注射GSK-3β专一性抑制剂SB216763的方法使GSK-3β活性受到抑制,而后行大部肝切除术,取不同再生时间点的标本检测再生肝细胞的增殖、凋亡以及分子生物学指标等。我们发现GSK-3β在肝切后0.5h内即发生大量核转位;其次使用GSK-3β专一性抑制剂SB216763抑制其活性可导致大鼠肝切后24h的再生肝细胞增殖减少,凋亡增加,凋亡蛋白活性增强;再者抑制GSK-3β活性可下调转录因子NF-κB的DNA结合活性及其下游基因iNOS和IL-6的表达;此外GSK-3β活性受抑制使再生肝细胞的p21和COX2的表达也受到不同影响。因此我们认为GSK-3β参与了肝再生初期的调控。其作用机制包括促进NF-κB信号通路活性和下游基因表达;以及增强COX2表达和抑制细胞周期抑制蛋白p21表达,从而保护肝细胞、促进细胞周期进程。
肝细胞肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,目前已成为我国第二位的恶性肿瘤致死原因。肝癌治疗目前仍以手术为主的综合治疗,但中晚期患者常常由于肝癌发生了转移而失去实施手术的机会。而在临床中,肝癌的侵袭转移和术后复发是患者死亡的主要原因。所以,肝癌的转移与复发成为当前肝癌治疗研究的热点问题。虽然目前对肝癌转移的相关因素研究较多,但确切的机制仍不清楚。新近的研究表明,糖原合成酶激酶(GSK)-3β在细胞的迁移过程中起可能起到重要作用。
也许 GSK-3是一个丝氨酸/苏氨酸类激酶,早期研究认为该酶的功能在于磷酸化肝糖原合成酶(GS)并使之失活。后来研究表明,该酶可磷酸化众多底物,从而发挥调节细胞增殖、凋亡等许多重要的细胞功能,在蛋白合成、细胞增殖、细胞分化和细胞运动等诸多方面,都扮演着相当重要的角色。GSK-3广泛的存在于真核生物中,在哺乳动物体内发现有两种亚型存在,即GSK-3α和GSK-3β,GSK-3β是两个亚型中较小的一个,由482个氨基酸组成,分子量为47kD。GSK-3β最初由骨骼肌中分离出来,但该酶广泛表达于动物的所有组织,特别在大脑。GSK-3β与多种情况下的细胞凋亡有关,但是确切的机制还不是很清楚。
selleck screening library 目前已有研究表明GSK-3β在肝癌的发生发展过程中起到了重要作用,并参与了肝癌细胞生长和细胞凋亡信号通路调控。Patricia等人发现,通过抑制GSK-3β的活性可有效地抑制肝癌细胞的生长。但是,GSK-3β是否参与了肝癌细胞的转移仍然是个有待于研究的问题。因此,本研究通过改变GSK-3β的活性来观察其对肝癌细胞迁移能力的影响,以期了解GSK-3β在肝癌细胞迁移过程中所扮演的角色,为原发性肝癌的治疗提供新的靶点。 1.下调GSK-3β活性对肝癌细胞迁移能力的影响 目的:通过药理学方法抑制GSK-3β活性观察其对肝癌细胞迁移速度的影响。方法:应用药理学方法,以GSK-3β特异性的抑制剂LiCl和SB216763分别抑制SMMC-7721和Hep3B细胞中GSK-3β的活性,通过划痕试验检测不同活性状态下肝癌细胞迁移能力的差别。结果:划痕24h后,SMMC-7721细胞的相对迁移率分别下降36.44%和41.78%;Hep3B细胞的相对迁移率都下降26.66%。其中,SMMC-7721细胞对抑制剂的反应比Hep3B细胞更敏感,迁移率降低40%左右。并且发现Hep3B细胞对SB216763和LiCl敏感程度相当,而SMMC-7721对SB216763较为敏感。结论:应用GSK-3特异性抑制剂后,单位时间内肝癌细胞Hep3B和SMMC-7721的迁移率较对照组明显降低,证明GSK-3β的活性下调后肝癌细胞的迁移能力降低。 2.GSK-3βS9A、GSK-3βWT、GID5-6对肝癌细胞迁移能力的影响: 目的:通过调节GSK-3β活性观察其对肝癌细胞迁移速度的影响。方法:应用载体表达法,通过chamber小室观察转染不同质粒后,SMMC-7721肝癌细胞迁移能力的变化。结果:转染GSK-3βWT、GSK-3βS9A后,肝癌细胞中GSK-3β的活性被增强,而其相对迁移率却分别下降为30.9%和18.09%;而转染GID5-6后,肝癌细胞的相对迁移率下降为18.04%。结论:肝癌细胞的迁移能力不仅与GSK-3β的活性有关,也与其他一些影响因素相关。结合GSK-3β在神经细胞的发育过程中,p-GSK-3β的不对称分布影响其极性形成这一事实,我们认为p-GSK-3β的不对称分布可能也参与影响肝癌细胞迁移的过程之中。 3.