了解高糖和AGEs联合刺激对THP-1细胞氧化应激的影响; 很少 3.了解HO-1在高糖和AGEs所致THP-1细胞氧化应激中的表达变化; 4.探讨p38MAPK信号通路是否参与了高糖和AGEs诱导的THP-1细胞HO-1表达。 【方法】 1.细胞培养:采用含10%胎生血清的RPMI1640培养基,于37℃、5%CO_2培养箱内传代培养人单核细胞株THP-1。
2.体外制备AGEs:将牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)与葡萄糖混合于37℃孵育60天,4℃透析24tl以去除未结合的葡萄糖。 3.细胞ROS产量检测:分别用5、15、25mmol/L的GLU或25、50、100μg/mL的AGEs刺激细胞,分别于刺激0.5、2、6、24h后收集细胞,DCFH-DA荧光探针标记,流式细胞仪检测平均荧光强度(mean fluorescence intensity,MFI)。 4.细胞分组:分为4组,即15mmol/LGLU组(高糖组)、100μg/mLAGEs组(AGEs组)、15mmol/LGLU+100μg/mLAGEs组(高糖+AGEs联合组)及对照组。 5.细胞培养液上清TNFa水平检测:采用ELISA方法进行。 6.细胞培养液上清中MDA水平检测:采用硫代巴比妥酸法(thiobarbituric acid,TBA),严格按照试剂盒说明步骤检测。 7.RT-PCR法检测HO-1mRNA表达:提取总核糖核酸(ribonucleic acid,RNA),两步法进行RT-PCR,扩增产物于1.5%琼脂糖凝胶进行电泳。 8.免疫印记(western blot,WB)法检测HO-1蛋白表达:提取总蛋白,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectropheresis,SDS-PAGE),电转移至硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter,NC)封闭非特异位点。利用多克隆兔抗人HO-1抗体及HRP标记的二抗与NC反应,DAB显色后拍照分析条带亮度。 9.SB203580(SB,p38MAPK抑制剂)干预实验:分为高糖组、SB+15mmol/LGLU(SB+高糖)组、AGEs组、SB+100μg/mLAGEs(SB+AGEs)组。10μmo/LSB干预30min后换以含15mmol/LGLU或100μg/mL 那个 AGEs细胞培养液继续孵育24h,收集细胞进行RT-PCR检测HO-1mRNA表达水平。 10.统计学处理:用SPSS13.0软件对所有数据进行统计学处理;实验数据计量资料以均数±标准差((?)±s)表示。多组间资料比较用析因设计的方差分析(ANOVA),任意两组间比较采用独立样本的t检验,相关分析采用积矩相关系数(Pearson相关系数)分析,检验标准为α=0.05。 【结果】 1.制备的AGEs浓度:AGEs的荧光浓度为101.29U/mg,对照BSA的荧光浓度为13.68 U/mg,前者为后者的7.40倍。
2.GLU和AGEs刺激THP-1细胞的ROS产量:均表现为0.5h的ROS产量急剧升高,随着时间延长轻度下降,但于24h再度上升至较高水平,在6h、24h时间点的ROS产量表现为GLU和AGEs浓度依赖性升高。高糖组(65.88±1.61)和AGEs组(67.46±3.78)的ROS产量均显著高于对照组(41.95±1.36)(P＜0.001),高糖+AGEs联合组(107.21±8.94)显著高于GLU组和AGEs组(P＜0.01),且高糖和AGEs对ROS产量的影响具有协同作用(P＜0.05)。 3.细胞培养液上清的MDA水平(nmol/mL):高糖组(1.59±0.53)显著高于对照组(0.65±0.23)(P＜0.05),AGEs组(1.56±0.97)虽然也高于对照组,但统计学差异不明显(P＞0.05),高糖+AGEs联合组(3.26±0.32)显著高于GLU组和AGEs组(P＜0.05)。 4.细胞培养液上清的TNFa水平(pg/mL):高糖组(25.38±1.95)和AGEs组(24.43±2.65)显著高于对照组(14.97±1.49)(P＜0.01),高糖+AGEs联合组(51.25±1.72)显著高于高糖组及AGEs组(P＜0.001),高糖和AGEs对TNFa的影响存在协同作用(P＜0.001)。 5.细胞HO-1mRNA的表达:高糖组(0.42±0.02)和AGEs组(0.48±0.03)显著高于对照组(0.15±0.01)(P＜0.001),高糖+AGEs联合组(0.89±0.12)显著高于高糖组及AGEs组(P＜0.05)。 6.THP-1细胞的HO-1蛋白表达:高糖组(0.39±0.01)和AGEs组(0.45±0.03)显著高于对照组(0.15±0.01)(P＜0.05),高糖+AGEs联合组(0.81±0.02)显著高于高糖组及AGEs组(P＜0.05),高糖和AGEs存在协同作用(P＜0.01)。
7.相关分析:HO-1蛋白表达水平与HO-1mRNA、ROS产量、MDA及TNFα均呈显著正相关(P＜0.001)。HO-1mRNA与ROS、MDA及TNFα均呈显著正相关(P＜0.001)。ROS产量与MDA、TNFα呈显著正相关(P＜0.001)。TNFα与MDA呈显著正相关(P＜0.001)。 点击此处 8.SB203580(SB)(p38MAPK抑制剂)干预实验结果:各组之间HO-1mRNA表达均无显著的统计学差异(P＞0.05)。 【结论】 1.高糖和AGEs单独刺激能导致THP-1细胞氧化损伤加剧、分泌炎症因子TINFα水平及HO-1表达增高,二者联合刺激能使上述改变进一步加剧。 2.p38MAPK抑制剂对高糖和AGEs诱导的THP-1细胞HO-1mRNA表达无显著影响。 3.HO-1表达与细胞氧化损伤及炎症指标呈显著正相关,提示高糖和AGEs导致THP-1细胞氧化损伤及炎症反应,后者诱导HO-1表达适应性和代偿性增高,从而发挥细胞保护作用。 第二章抑制HO-1对高糖和AGEs致THP-1细胞氧化应激的影响 【目的】 探讨抑制HO-1表达对高糖和AGEs刺激下THP-1细胞氧化应激的影响。 【方法】 1.细胞分组:分为4组,即对照组、15mmol/LGLU+100μg/mLAGEs(GLU+AGEs)组、ZnPP组及ZnPP+15mmol/LGLU+100μg/mLAGEs(ZnPP+GLU+AGEs)组,其中对照组和ZnPP组THP-1细胞培养液的GLU浓度均为5mmol/L。 2.细胞ROS产量、细胞培养液上清中MDA及TNFa水平、HO-1mRNA及蛋白表达水平检测同第一章。 3.统计学处理:用SPSS13.0软件对所有数据进行统计学处理。实验数据计量资料以均数±标准差((?)±s)表示。多组间资料比较用析因设计的方差分析(ANOVA),任意两组间比较采用独立样本的t检验,检验标准为α=0.05。 【结果】 1.各组细胞ROS产量(MFI)的比较:ZnPP+GLU+AGEs组(128.