我们用Rg3(50μg/ml)处理胃癌细胞,通过ELISA检测FUT4、SP1和HSF1的表达。 13.CCK-8检测细胞增殖的能力。 IV.实验结果 1. H.pylori和CagA对细胞增殖的影响机制的研究 (i)与胃炎,胃溃疡的患者相比,胃癌组织和血清中Cag A、p-EGFR、FUT4和LeY的表达增高。

(ii)在胃癌组织和血清中,Cag A与p-EGFR、FUT4和LeY的表达相关。 (ⅲ) Cag A促进细胞增殖并且呈剂量依赖性。 (ⅳ) Cag A上调PCNA的表达及EGFR、ERK1/2和P38的磷酸化水平。 (ⅴ) Cag A上调FUT4的表达并呈剂量依赖性。 (ⅵ) Cag A上调LeY、LeB、LeX和sLeX的表达。 2.塞来昔布和LeY寡糖抗体抑制细胞增殖的机制的研究 (i)与普通胃上皮细胞相比,胃癌细胞增殖能力强。 (ii)与胃炎,胃溃疡的患者相比,胃癌组织和血清中H. pylori、COX-2、CA724和GRN的表达上调。 (iii)在胃癌中,H. pylori的表达和LeY、COX-2、CA724及GRN的表达相关。 (iv)塞来昔布抑制FUT1、FUT4和LeY的表达。 (v)LeY调节H. pylori的毒性。 (vi)联合使用塞来昔布和LeY寡糖抗体处理细胞,能抑制胃癌细胞的增殖。 3.Rg3对胃癌细胞凋亡的作用机制的研究 无 (i)Rg3通过激活caspase-3,-8,-9及PARP的裂解促进胃癌细胞凋亡。 (ii)在胃癌细胞中,Rg3下调FUT4的表达。 (ⅲ) CagA调节SP1和HSF1的表达。 (iv)Rg3调节SP1和HSF1的表达。 (v)SP1和HSF1调节FUT4的表达。 V.结论 1.胃癌中CagA、pEGFR、FUT4和LeY的表达升高；CagA通过EGFR/MAPKs信号通路促进FUT4和LeY的表达。 2.LeY抗体增加塞来昔布的抗肿瘤作用；LeY抗体和塞来昔布通过抑制COX-2和LeY的表达及其介导的MAPKs/COX-2信号通路抑制肿瘤细胞的增殖。

3.Rg3通过调节SP1和HSF1的表达而下调FUT4的表达,达到治疗肿瘤的效果。 4. FUT4/LeY、COX-2/LeY和SP1/HSF1可能是胃癌的潜在治疗靶点。
目的 宫血宁胶囊（GXN）是利用云南省道地中药材重楼开发的总甾体皂苷（TSSPs）制剂，目前已成为国内妇科专家首推的治疗妇科血症的中成药制剂。在既往的研究中我们已经发现GXN能够增强子宫收缩和促凝血功能是治疗异常子宫出血（AUB）的两个关键药效学基础，并通过植化研究鉴定出十余种甾体皂苷，进行构效关系分析确定了具有螺甾结构的偏诺类皂苷具有显著的促子宫平滑肌收缩活性，并且研究证实了单体Tg引起大鼠血小板聚集、促进凝血的信号转导通路。然而，甾体皂苷引起子宫平滑肌收缩的药理学作用，尤其是作用的信号转导通路尚不十分清楚。本研究的目的在于探索中药甾体皂苷诱导子宫平滑肌收缩的信号转导通路，明确甾体皂苷缩宫作用机制，为寻找作用靶点以及药物的二次开发提供理论依据。 内容 明确偏诺皂苷Tg诱导的大鼠子宫平滑肌收缩与MLC20磷酸化的关系；探讨PLC-IP3、RhoA/ROK、ERK/MAPK、P38/MAPK、JNK/SAPK和PKC等可能通路的参与与否以及通路间的相互作用；构画Tg引起子宫平滑肌收缩的分子机制图。 方法 选用120~140g的雌性SD大鼠、采用组织块贴壁法进行原代大鼠子宫平滑肌细胞的分离和培养；利用离体子宫平滑肌收缩实验研究Tg的体外效应和各种抑制剂对Tg作用的影响；采用蛋白免疫印迹（Western blotting）技术检测可能涉及的信号通路中信号蛋白肌球蛋白轻链（MLC20）、ERK、p38、JNK和钙调结合蛋白（CaD）的磷酸化改变；利用细胞内钙离子标记、激光共聚焦检测平滑肌细胞内钙离子浓度的变化。 Selleck VX-770 结果 1. Tg引起子宫平滑肌收缩效应的确定以及收缩与MLC20磷酸化效应的关系 寻找更多 从总甾体皂苷（TSSPs）中分离提取的单体化合物Tg具有显著的促子宫平滑肌收缩作用，作用的起始浓度为1.25μM，随着给药浓度的增加，收缩效应逐渐增强。已知生理状态下平滑肌细胞内p-MLC20表达水平与平滑肌收缩密切相关，为了揭示Tg诱导的大鼠子宫平滑肌收缩作用是否与平滑肌细胞内MLC20磷酸化关联，采用western

blotting技术评价Tg刺激后胞内MLC20磷酸化水平的改变，发现Tg能够呈剂量和时间依赖性诱导组织细胞内p-MLC20表达水平的升高。MLC20磷酸化反应通常由MLCK介导，应用MLCK特异性抑制剂ML-7能够显著抑制Tg诱导的MLC20磷酸化以及子宫平滑肌收缩。而MLCK主要通过活化的CaM来激活，应用CaM特异性抑制剂W-7也能显著抑制Tg诱导的p-MLC20水平升高及子宫平滑肌收缩效应。 2.平滑肌细胞[Ca2+]i对MLC20磷酸化和Tg缩宫作用的影响 为了验证[Ca2+]i在Tg引起子宫平滑肌收缩以及MLC20磷酸化效应中的角色，研究首先从检测[Ca2+]i水平的改变入手。以2.5μM Tg刺激预先以Fluo4-AM共孵育的子宫平滑肌细胞，激光共聚焦显微镜下可见Tg刺激后，细胞内荧光强度显著性增高，作用12s出现荧光强度的峰值，持续1-2s后很快下降，提示Tg能够刺激子宫平滑肌细胞内[Ca2+]i瞬时升高，形成“钙振荡”。去除细胞外钙或利用L型钙离子通道阻断剂尼群地平以阻断外钙内流，或利用thapsigargin内钙耗竭剂阻断内钙释放，都能显著抑制Tg诱导的子宫平滑肌收缩以及p-MLC20水平的升高。应用PLC/IP3信号通路的特异性抑制剂几乎完全抑制Tg的缩宫作用以及p-MLC20水平升高。另外，Rethunium Red（兰尼碱受体（RYR）的特异性阻滞剂）能够阻止钙离子与受体的结合，从而抑制Ca2+引发的Ca2+释放（CICR），应用54μM Rethunium Red能抑制Tg缩宫作用的发挥。 3. RhoA/ROK信号通路在Tg缩宫机制中的调节作用 RhoA/ROK信号通路的激活可以通过使MLCP失活而提高p-MLC20浓度。应用ROK特异性抑制剂Y27632的既能够抑制Tg引起的子宫平滑肌收缩，也能抑制平滑肌细胞内p-MLC20升高。 4. ERK/MAPK信号通路在Tg诱导的子宫平滑肌收缩中的调节作用 MEK特异性抑制剂U0126能够抑制Tg诱导的子宫平滑肌收缩，主要表现为收缩频率的降低；并且，Tg呈剂量和时间依赖地引起子宫平滑肌细胞内ERK1/2磷酸化水平的升高，这一效应能够被U0126完全抑制；Tg还能引起CaD的磷酸化效应增强，可以被U0126部分抑制。为了验证ERK/MAPK通路的激活是否由ras/raf途径介导，检测raf蛋白的表达发现Tg尚能够引起平滑肌细胞内p-c-Raf表达的升高，具有时间依赖性；而应用ras阻断剂可以抑制Tg诱导p-ERK1/2升高。 5.