方法以含TET1全长cDNA序列的质粒为模板,通过PCR扩增得到TET1基因,酶切连接后构建pLenti-GFP-TET1过表达慢病毒载体,琼脂糖凝胶电泳和测序验证后,通过包装、感染和嘌呤霉素筛选,获得稳定表达GFP-TET1的人宫颈癌CaSki细胞,通过Western blot检测TET1的表达情况,免疫荧光染色确定TET1亚细胞定位,细胞增殖曲线和软琼脂克隆形更多成实验检测TET1过表达对细胞增殖和细胞克隆形成能力影响;流式细胞检测TET1过表达细胞周期变化。结果酶切鉴定及测序结果均显示成功构建pLenti-GFP-TET1过表达的慢病毒载体,包装病毒后感染CaSki细胞获得TET1稳转细胞系;定量PCR和Western blot结果显示稳转细胞系中TET1 mRNA(P<0.001)和蛋白表达水寻找更多平显著高于对照细胞;细胞增殖和克隆形成实验结果显示TET1过表达明显抑制细胞增殖(P<0.001)和克隆形成数目(P<0.01);免疫荧光染色结果表明TET1定位于整个细胞;细胞周期结果显示TET1过表达影响。结论我们成功的获得了pLenti-GFP-TET1稳定过表达的细胞系,并且初步探讨了过表达TET1在宫颈癌细胞中的作用。
Dibutyryl-cAMP小鼠
目的探讨骆驼蓬碱介导COX-2表达水平抑制骨肉瘤细胞增殖与凋亡的作用。方法体外培养人骨肉瘤细胞U2OS细胞系,随机分为对照组、研究组1、研究组2和研究组3,分别在0、5、10、20μmol/L浓度骆驼蓬碱条件下培养48 h。分别使用CCK-8法和流式细胞术检测细胞活力和细胞凋亡情况。并分别使用Western blot和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测COX-2、增殖和凋亡相关蛋白和mRNA的表达水平。