构建Pthlh不同长度报道基因，利用双荧光素酶基因报告系统研究突变X对Pthlh转录活性的影响。 实验结果： 一、PTH1-34可治疗FGFR3功能增强的软骨发育不良 1. PTH处理可使TDII小鼠存活，但存活的TDII小鼠仍然存在骨骼发育障碍：个体短小、骨骼短缩弯曲、生长板结构紊乱、颅底软骨连接提前闭合、骨小梁减少等； 2. PTH处理促进ACH小鼠大体生长，缓解其头颅圆钝，促进其次级骨化中心出现，以及改善其成年期骨量减少； P450 pathway 抑制剂s 3. PTH可促进培养骨组织生长，并主要通过促进软骨生长发挥作用； 4. PTH可促进ACH小鼠肢芽Micromass软骨小结形成及基质分泌； 5. PTH对ACH软骨的影响可能通过降低FGFR3的表达及活性，促进PTHrP表达来完成。 二、FGFR3参与终板/椎间盘稳态维持 1. ACH小鼠终板自发性退变—-骨化较WT小鼠延迟； 2.全身及软骨内敲除FGFR3小鼠脊柱侧弯、骨量减少、椎体生长板及终板结构紊乱，椎体/椎间盘发退变较野生小鼠提前：骨赘生成； 3.成年期软骨细胞敲除FGFR3后小鼠椎间盘终板出现退变的早期表现：软骨基质丢失，终板出现类似异位成骨的骨样组织，成骨标记OC、软骨基质降解酶MMP13表达增加。
三、突变X基因抑制软骨发育及Pthlh转录活性 1.突变X基因抑制软骨增殖、基质分泌及降低软骨分化相关基因Col2、Col10、Aggrecan、PTHrP及FGFR3表达； 2.突变X可能通过pthlh基因启动子上的AP1结合位点抑制其转录活性。 结论： 一、PTH1-34可治疗FGFR3功能增强所致软骨发育不全及致死性发育不良 二、FGFR3对终板/椎间盘退变有一定的保护作用 三、突变X基因可能通过抑制软骨增殖分化、Pthlh转录活性及促进FGFR3表达导致软骨发育障碍
TLR2(Toll like receptor2)作为固有免疫受体家族的重要成员,参与机体免疫系统抵御体内及体外危险因素的攻击。近期研究表明TLR2还参与包括癌症、自身免疫及心脑血管等多种疾病的发生和进展。本研究发现TLR2在急性粒细胞性白血病细胞高表达。因此靶向TLR2进行药物开发对多种疾病具有很好的治疗前景。本研究主要通过构建TLR2特异性配基细胞筛选模型,从噬菌体展示肽库中筛选出与TLR2特异性结合的多肽。以多肽为载体偶联不同治疗性物质,靶向治疗急性粒细胞白血病和肿瘤。具体内容主要分为以下三部分：
1.TLR2特异性配基细胞筛选模型的构建、验证及TLR2配基多肽的筛选。 为了构建TLR2特异性配基细胞筛选模型,我们将TLR2及其辅助型受体CD14、 TLR1和TLR6的表达质粒与TLR2信号通路NF-κB启动子荧光素酶报告基因质粒共转染至人胚肾HEK293细胞,经过筛选得到稳定表达细胞株。利用这一筛选系统从噬菌体展示7肽库中通过生物淘洗-快速差异筛选配基方法(BRASIL)筛选出与TLR2特异性结合的肽段Pep2和C8,经ELISA、流式细胞术和细胞免疫荧光方法鉴定以上肽段均能特异性结合TLR2。通过荧光素酶活性实验验证肽段C8作为TLR2配基激活TLR2/TLR1信号通路；激光共聚焦实验验证肽段Pep2作为靶向TLR2的细胞穿膜肽经受体内化进入细胞。综上所述,通过以上实验证明我们成功构建了TLR2特异性配基的细胞筛选模型,并且筛选到靶向结合TLR2的多肽。
或者 2.以靶向TLR2细胞穿膜肽Pep2为载体治疗急性粒细胞性白血病和淋巴瘤 细胞穿膜肽作为新的靶向药物传输载体在多种癌症治疗中具有高效低毒的优点。本研究发现TLR2在急性粒细胞性白血病(AML)和多种淋巴瘤细胞中高表达。为了验证靶向结合TLR2的细胞穿膜肽Pep2是否可以作为新的药物传输载体用于治疗AML,我们将该肽段偶联上一段促进细胞凋亡的多肽D(KLAKLAK)2,组成新的嵌合肽Pep2-D(KLAKLAK)2。实验结果表明Pep2-D(KLAKLAK)2可以靶向促进高表达TLR2(TLR2high)的AML细胞发生凋亡,而对低表达TLR2(TLR2low)的慢性粒细胞性白血病(CML)细胞则没有作用。Pep2-D(KLAKLAK)2抗白血病效应进一步在白血病临床骨髓样本和小鼠模型中得到验证。白血病小鼠骨髓切片TUNEL染色表明此嵌合多肽以TLR2依赖性方式促进AML细胞凋亡。综上所述,本研究证明TLR2可以作为治疗AML和淋巴瘤的潜在靶点,而嵌合多肽Pep2-D(KLAKLAK)2是一个有开发价值的候选药物。 以及 3.以细胞穿膜肽Pep2为载体靶向抑制TRB3的功能抑制肿瘤发生与进展 肿瘤细胞的过度增殖、侵袭和转移涉及一系列相关基因的表达和功能异常。TRB3(Tribbles Homologue3)在多种肿瘤细胞及肿瘤组织中高表达。为了探究TRB3与肿瘤发生和进展的关系,本研究发现抑制肿瘤细胞内TRB3的高表达能抑制肿瘤细胞的自噬活性。本研究深入探讨了TRB3调节自噬的分子机制,发现TRB3主要与自噬通路的“货车蛋白”P62相互作用,进而干扰P62与泛素化蛋白以及自噬标志蛋白LC3的结合,造成自噬活性被抑制,从而促进肿瘤的发生和进展。本研究进一步发现干扰肿瘤细胞内TRB3的表达显著降低肿瘤细胞的增殖、侵袭及转移能力,提高荷瘤动物生存率。这些结果提示TRB3是治疗肿瘤的一个潜在靶点。利用这一机制,本研究从P62蛋白结构域中筛选出一段靶向结合TRB3的具有α螺旋结构的肽段,以细胞穿膜肽Pep2作为载体将其带入肿瘤细胞。结果显示该嵌合肽能干扰TRB3与P62的结合,激活肿瘤细胞自噬活性,在体内和体外起到抑制肿瘤生长和转移的作用。综上所述,我们的研究证明TRB3能作为连接自噬和肿瘤的桥梁,靶向阻断P62/TRB3之间相互作用可以明显抑制肿瘤发展。
多囊肾病(polycystic kidney disease,PKD)是指双侧肾脏发生多个囊肿且进行性长大而导致肾脏结构和功能损害的一种单基因遗传性疾病。根据遗传方式的不同多囊肾可以分为两种：常染色体显性遗传性多囊肾病和常染色体隐性遗传性多囊肾病。在北美大约有500,000受累ADPKD的发病率为1/500-1000,ARPKD的发病率为1/40000。B6C3Fe ala-bpck是一种常染色体隐性遗传性多囊肾(ARPKD)的动物模型。缺失的TMEM67基因与人类的MKS3以及Wistar大鼠多囊肾模型具有同源性。 目的： 在确定此模型作为ARPKD研究的可行性后,构建含目的基因TMEM67全长的载体pFlag-CMV-TMEM67.