..
猪链球菌血清2型(Streptococcus suis serotype2)是一种重要的人畜共患病病原体，猪链球菌感染具有较高的病死和病残率，其最主要的临床症状是脑膜炎，与其它细菌性脑膜炎相似，我们认为猪链球菌致脑膜炎的过程也是多步骤的，其中最关键的步骤是猪链球菌如何穿过血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)进入中枢神经系统。 BBB是重要的结构和功能屏障，在维护中枢神经系统（CNS）免受血液中的有害物质和微生物的侵入方面起重要作用，其主要由脑微血管内皮细胞（BMEC）、星形胶质细胞和周细胞组成，而脑微血管内皮细胞是其最主要的组成部分。因此，猪链球菌与脑微血管内皮细胞相互作用的研究对揭示猪链球菌穿过BBB的作用机制，进而研究猪链球菌致脑膜炎的机制均有重要意义。 我们课题组在前期工作中，利用人脑微血管内皮细胞（hCMEC/D3），这一国内外公认的模拟BBB较好的细胞系，建立了人BBB体外模型，并确认了猪链球菌以细胞旁的途径穿过BBB。本研究旨在利用建立的人BBB体外模型，筛选可能影响猪链球菌穿BBB能力的毒力因子，并研究分析其作用机制。本研究筛选了本课题组前期发现的多个可能毒力基因如SSU05_1000，SSU05_MRP，SSU05_1815及SSU05_1664等在猪链球菌穿血脑屏障过程中的作用。实验结果表明，敲除SSU05_1000，SSU05_MRP基因后，猪链球菌穿BBB能力显著下降，而敲除其它毒力基因对猪链球菌穿BBB能力无显著影响。因此，我们推测SSU05_1000，SSU05_MRP很可能在猪链球菌穿BBB过程中发挥重要作用。

很少 SSU05_1000是本课题组新发现的细胞壁蛋白，具有较强的免疫原性。本课题组前期动物实验结果表明：SSU05_1000有助于猪链球菌抵抗免疫细胞的杀伤，从而实现血中存活，有助于细菌进入脑部。但是，具体的作用机制并不清楚，且目前尚未有对该蛋白的研究报道。 为了研究SSU05_1000在猪链球菌穿BBB过程中作用机制，本研究对该基因进行了重组表达和纯化。首先，构建pET30a-SSU05_1000重组表达质粒，并将其转入表达菌株大肠杆菌BL21（DE3）中。IPTG诱导后，SDS-PAGE电泳显示该蛋白为在细菌裂解液上清中，为可溶性表达，然后利用镍亲和层析法对该蛋白进行纯化，得到纯度90%以上的重组SSU05_1000蛋白，并用TritonX-114去除污染的脂多糖（LPS）。

为了验证SSU05_1000基因在猪链球菌穿血脑屏障过程中的作用，将获得的重组蛋白预处理hCMEC/D3细胞，然后评价05ZYH33△1000的穿过能力。结果表明：SSU05_1000蛋白可以使05ZYH33△1000穿膜能力恢复到05ZYH33野生株水平。为了分析猪链球菌穿血脑屏障过程中激活的信号通路，本研究筛选了多种信号通路的抑制剂。研究结果表明：p38MAPK和JNK通路抑制剂预处理hCMEC/D3细胞后，能显著降低猪链球菌穿血脑屏障能力。提示：猪链球菌在穿血脑屏障过程中可能需要激活MAPK信号通路。在此基础上，本研究进一步研究了SSU05_1000蛋白与MAPK信号通路激活之间的关系。Western blot检测结果显示SSU05_1000可以激活p38，JNK信号通路。 综上所述，本研究结果提示SSU05_1000通过激活p38, JNK信号通路从而破坏BBB的完整性，打开细胞间隙，有助于猪链球菌穿过BBB。
软骨内成骨及膜内成骨过程是骨骼形成的两种主要方式。软骨内成骨过程包括软骨雏形形成和骨形成，首先聚集的骨髓间充质细胞分化为软骨细胞，然后开始软骨内成骨过程为软骨细胞增殖、分化和凋亡，凋亡的肥大软骨细胞随新生的血管一同进入成骨细胞，最终以矿化的软骨基质区为中心开始成骨过程。软骨生长板是长骨纵向生长的重要场所，调控长骨的纵向生长速度[1]。

还有 软骨内成骨过程被很多生长因子所介导的信号通路所调控，其中包括FGFs(Fibroblast Growth Factors，成纤维细胞生长因子)。FGFs要与其特异性的受体FGFR1-4(Fibroblast Growth Factor Receptor，成纤维细胞生长因子受体)结合才能发挥功能。既往研究发现FGFRs突变影响骨发育，对骨细胞的增殖、分化，骨的形成起到关键作用[2-4]。 AS (Apert Syndrome，Apert综合征)是一种人类颅缝早闭综合征，以冠状缝早闭，颅面畸形和手足的并指/趾畸形为典型体征[5-6]。AS90%是由两种FGFR2功能获得性突变，即FGFR2Ser252Trp或者Pro253Arg突变引起，其中67%是FGFR2Ser252Trp[7]。这两种突变都是影响FGFR2免疫球蛋白样结构域II和III之间高度保守区域，使FGFR2可能获得对配体结合范围的扩大，从而使靶细胞的FGFR2信号持续增强[8]。 Cohen，Kreiborg发现AS患者除了骨发育反常外，颅底软骨发育及干骺端软骨等软骨发育也出现发育障碍[6]。不仅如此，在之前建立的FGFR2突变小鼠模型中，也发现软骨内成骨发育异常，导致小鼠身材弱小，四肢及脊柱骨骼发育迟缓及颅底发育不良[9-11]。FGFR2主要其可激活下游MAPK[12-14]和PKC通路[14-15]，调控间充质干细胞增殖，影响直接成骨和软骨内成骨过程[11,16]。 我们利用条件打靶技术构建Fgfr2+/S252W模式动物，模拟Apert综合征。我们发现突变小鼠不仅表现出颅缝早闭，还有骨发育迟缓，体形弱小。这与FGFR2受体功能增强对成骨，软骨细胞影响有关。为了证实FGFR2在早期骨发育中的作用，我们利用同窝出生野生型及突变Fgfr2+/S252W小鼠进行比较，在出生后早期对骨发育进行形态、组织学观察及分子水平进行研究并比较两者BMSCs(Bone selleck chemical Mesenchymal Stem Cells，骨髓间充质干细胞)在软骨内成骨过程中的增殖、分化差异。我们并发现在FGFR2突变引起小鼠骨骼发育异常，可能是由p38及Erk1/2信号通路介导的。 实验结果： 1. FGFR2功能获得性突变使小鼠呈现出类似人类Apert综合征的典型骨骼表型，包括颅骨早闭，圆头畸形，身材矮小，有望成为研究Apert综合征的良好动物模型之一。 2. Fgfr2+/S252W小鼠软骨内成骨发育迟缓，骨量减少导致长骨纵向生长障碍。 3.组织学观察发现FGFR2持续增强导致干骺端生长板增殖、肥大软骨层缩短，抑制生长板细胞增殖，并且表达成软骨、成骨标志蛋白下降。 4. Fgfr2+/S252W突变小鼠骨髓基质细胞体外培养诱导实验提示，FGFR2功能持续增强抑制细胞增殖以及软骨细胞早、中期分化，但增强软骨细胞终末期成骨分化能力，最终抑制细胞矿化能力。 5.