角膜缝线法建立SD大鼠角膜新生血管模型建立大鼠右眼新生血管模型,在大鼠角膜缘内1mm等间距缝合3针,深及基质层。选取未缝线的正常角膜作为阴性对照组,并将缝线后大鼠随机分为缝线后第1日组,第3日组以及第7日组,每组8只。
2.显微镜下观察角膜缝线后每日在手术显微镜下观察,均放大16倍,注意角膜透明度、上皮完整性、缝线数量以及是否存在角膜感染。 所以 3.计算角膜新生血管面积计算角膜缝线后第1日、第3日以及第7日,分别在显微镜下测量角膜新生血管长度,并依据Robert公式计算角膜新生血管面积。 4. Western Blot检测缝线后角膜血管化进程中p38和磷酸化p38的表达缝线当日以及缝线后第1、3、7日,分别从各组随机选取5只大鼠,摘取角膜,收集角膜蛋白,采用Western Blot方法检测各组角膜p38以及磷酸化p38的表达,并检测目的蛋白IOD与内参GAPDH的IOD,二者比值作为目的蛋白的相对表达量。 5.免疫荧光检测p38和磷酸化p38在角膜上的表达按照分组分别在特定时间摘取角膜,采用免疫荧光的方法检测p38和磷酸化p38在角膜的表达以及定位。 6.统计学分析采用SPSS13.0软件分析,计量资料以均数±标准差表示。当方差齐性时,采用one-way ANOVA分析；方差不齐时采用Welch法校正。组间比较,当方差齐性时,采用LSD分析；当方差不齐性时,采用Dunnett T3进行分析。所有统计推断均采用双侧检验,检验水准α=0.05。 结果 1.显微镜下观察缝线后7d,角膜缘血管网充血,缝线处角膜水肿增厚,并随时间延长逐渐加重,缝线后3d,睫状充血明显,角膜缝线处角膜缘明显局限性充血,可见新生血管缓慢长入,每处约2-5支,缝线处角膜未见明显混浊,全角膜透明；缝线后7d,见大量新生血管长入透明角膜,新生血管呈密集网状,无法计数,部分新生血管长到缝线处,缝线处角膜轻度混浊并增厚。
2.角膜新生血管面积缝线后第1日,未发现新生血管；缝线后3、7d,角膜新生血管面积分别为4.1-1.22、7.26±0.72mm2；而正常角膜无新生血管。 还有 3.Western Blot结果 各组角膜p38的相对表达量为：正常角膜组0.5681±0.1074,缝线后第1日组为0.5512±0.0795,第3日组为0.5517±0.0908,第7日组为0.5641±0.1168；不同实验组间p38的表达量无显著性差异(F=0.037,P=0.990)。 各组角膜磷酸化p38的相对表达量为：正常角膜组0.2969±0.0475,缝线后第1日组0.6219±0.0609,第3日组0.2812±0.0602,第7日组为0.3149±0.0496；不同组之间磷酸化p38相对表达量有显著性差异(F=43.895,P=0.000)；以缝线后第1日最高,缝线后第3、7日次之；而正常角膜与缝线后第3、7日无显著性差异。 4.免疫荧光结果各组p38表达基本一致,主要分布在炎性浸润细胞,新生血管内皮细胞以及部分上皮细胞,主要定位于细胞浆；而磷酸化p38表达在炎性细胞、新生血管内皮细胞,主要定位于细胞核,在缝线后第1日高表达。
许多 结论 1.在大鼠角膜血管化进程中,p38表达基本恒定；而磷酸化p38在缝线后第1日,即出现高峰表达,而后迅速衰减,至缝线后第3、7日已基本恢复至正常。 2.大鼠角膜缝线后,早期即有p38信号通路的强激活,而后逐渐出现可观察到的角膜新生血管。 3.缝线后大鼠角膜新生血管化可能与p38信号传导通路激活相关。 4.p38信号传导通路的早期激活可能是缝线后角膜新生血管生长的始动因素之一。 第二部分结膜下注射50μmol/L p38信号传导通路抑制剂SB203580对大鼠角膜的毒性作用 目的 研究结膜下注射SB203580对大鼠角膜的毒性作用,探索结膜下注射SB203580的合适浓度,探讨结膜下注射SB203580用于阻断p38信号传导通路的可能性,为后续实验奠定基础。 方法 1.配置50μmol/L SB203580溶液取0.05mL预冷的二甲基亚砜加入1mgSB203580中,振荡,然后加入预冷的生理盐水53.00mL,充分振荡混匀。按每支1mL分装于无菌冻存管中,-20℃冻存备用。 2.实验分组SD大鼠适应性饲养1周,裂隙灯显微镜检查排除大鼠结膜、角膜疾病后,随机分为50μmol/L SB203580组和生理盐水组,每组10只。 3.结膜下注射均选右眼进行实验,在角膜缘外0.5～1.0mm,沿顺时针方向,在12,2,4,6,8,10,12点位注射,依次每日选取1个注射点,每日1次行结膜下注射,共7d。按照实验分组分别注射50μmol/L SB203580和生理盐水0.04mL。 4.实验观察以及角膜炎症指数评分在裂隙灯显微镜下观察注射点结膜充血情况、角膜透明情况以及上皮是否完整等。结膜下注射7d后,在裂隙灯下观察中央角膜水肿程度、周边角膜水肿程度以及睫状充血程度行角膜炎症指数评分。 5.组织学及透射电镜观察结膜下注射7d后,摘取角膜,沿中心线剖切一分为二。一半用40g/L多聚甲醛固定,常规制作石蜡切片,苏木精-伊红染色观察组织学改变；另一半迅速用预冷的25g/L戊二醛固定,常规丙酮梯度脱水、渗透、包埋,超薄切片,醋酸铀及柠檬酸铅双重染色,透射电镜观察。 6.统计学分析采用SPSS13.0软件分析,计量资料以均数±标准差表示,组间比较采用T检验,所有统计推断均采用双侧检验,检验水准a=0.05。 结果 1.动物观察裂隙灯显微镜下观察发现SB203580注射部位结膜呈可逆性贫血状改变,注射次日即消失；在注射过程中,连续观察见角膜始终透明,上皮层无水肿、无剥脱。 2.在连续结膜下注射SB203580或生理盐水7d后,两组大鼠角膜炎症指数分别为：0.14±0.07,0.21±0.10,两组间炎症指数无显著性差异(t=1.716,P=0.103)；其中两组睫状充血程度评分分别为：0.70±0.48和1.30±0.67,生理盐水组睫状充血程度评分显著高于SB203580组(t=2.286,P=0.035)。 3.