0001-0.05)。为了进一步验证新型药物组合协同抑制KRAS突变实体瘤生长的机制,提取肿瘤组织RNA和蛋白质进行Q-PCR分析及免疫印迹实验。实验结果显示,联合用药组上调肿瘤组织中p21的表达,上述结果说明联合抑制PLK1和ROCK信号通路可通过增加p21的表达诱导有丝分裂压力发挥强烈抑制KRAS突变肿瘤的作用,为KRAS突变肿瘤的治疗提供了新的策略。综上所述,本研究揭示了能扰乱KRAS对其协同致死基因的依赖性的新型药物组合,靶向肿瘤细胞基因型的药物组合研究具有相当的医学转化价值,可以指导KRAS突变肿瘤的临床治疗。
第一部分EPAS1通过EGFR和MET信号通路调控非小细胞肺癌TKI耐药性目的:肺癌已成为我国城市人口恶性肿瘤死亡原因的第1位的恶性肿瘤。非小细胞肺癌包括常见的鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌等,与小细胞癌相比其癌细胞生长分裂较慢,扩散转移相对较晚。非小细胞肺癌约占所有肺癌的80%,其中约75%的患者发现时已处于中晚期,5年生存率很低。近年来随着药物基因组学的开展,非小细胞肺癌的药物相关研究大幅度提升,一方面,为更好地发挥化疗效应起到指导作用;另一方面越来越多的靶向药物被研制出来,在肿瘤治疗方面起到了许多令人鼓舞的成果。在肺癌的靶向治疗、转移因素、耐药性方面我们做了许多探索。目前针对第一代靶向治疗药物EGFR-TKI,以吉非替尼和厄洛替尼为代表,对于初治的非小细胞肺癌患者,中位PFS可达10个月,随之而来的耐药性函待解决。因此相关领域一些新的蛋白基因受体研究异常火热。本研究旨在探究是否有其他因子参与了EGFR与MET的调控,我们对全基因组中HIF-1α的类似物进行了筛查。其家族成员EPAS1在EGFR调控MET中的作用我们进行了系统研究,我们将HA标记的EPAS1(HA-EPAS1)与Myc标记的EGFR(Myc-EGFR)共同转染至HCC827细胞中,并使用HA的抗体进行免疫共沉淀实验。以确认这种结合是否具有细胞特异性,同时我们在A549中进行了相同的实验。为了进一步探究EPAS1和T790M

抑制剂 Library EGFR的结合是否为直接结合,我们使用了DTME作为交联剂进行蛋白交联实验。再者,为了研究MET信号通路是否受EPAS1与T790M

EGFR的相互作用影响,我们在HCC827细胞系中同时分别过表达EPAS1、野生型EGFR以及T790M EGFR,并检测MET的表达量。关于EPAS1与T790M EGFR是否依赖于配体,我们构建了配体结合域缺失的载体ΔN-T790M,并将其与EPAS1共同转染至HCC827细胞中。为了探究EPAS1与T790M EGFR的相互作用对NSCLC药物耐受的作用,我们将EPAS1与T790M EGFR共同转染至HCC827细胞中以EPAS1载体的空载作为对照,并使用吉非替尼和埃罗替尼处理细胞,用克隆实验检测分别共转染EASP1与T790M Selleckchem Selumetinib EGFR以及野生型EGFR对NSCLC对TKI处理的药物抵抗作用。最后为了探究EPAS1与T790M EGFR的相互作用是否通过MET信号通路来发挥作用的,我们敲低了内源的MET的表达并检测了细胞增殖和生长情况。方法:细胞培养NSCLC细胞系HCC827和A549购自美国ATCC(马纳萨斯)并且从收到细胞到完成文章不超过六个月时间。细胞用含10%胎牛血清,100U/ml青霉素,100μg/ml链霉素,2 m M-左旋谷酰胺的DMEM培养基培养,同时将细胞放入37℃含5%CO2的恒温培养箱中培养。质粒构建将EPAS1编码序列克隆到N端含HA标签的p CMV-HA质粒中,同时将配体结合域确实的突变型EGFR(氨基酸2-620)克隆到N端含Myc标签的pc DNA3.1质粒中。免疫荧光将HCC817转染HA-标记的EPAS1质粒并将细胞培养在细胞培养小室中,检测时用4%甲醛固定三十分钟,接着使用0.2%Triton

X-100破膜5分钟,使用5%BSA进行封闭。使用鼠源的抗HA的一抗室温孵育并使用Alexa Fluor 488羊抗鼠荧光二抗室温孵育30分钟后使用DAPI作为DNA染料。在抗体孵育后,细胞用PBS清洗并用抗荧光猝灭封片剂进行封片。免疫沉淀和蛋白免疫印迹蛋白裂解使用RIPA裂解液,配方为50 Trichostatin A订单 m M Tris-HCl,p H 7.4,150 m M Na Cl,1 m M EDTA,1%Triton X-100,1%脱氧胆酸钠,0.1%SDS并添加蛋白抑制剂。将裂解完的细胞用4℃的冰冻离心机12000rpm/min离心10min,将上清与琼脂糖球体以及抗HA和抗Myc的抗体4℃共同孵育2h。将孵育后的琼脂糖珠用裂解液清洗三遍后用最终洗脱液(50 m M Tris,p H 7.5,and 50 m M Na Cl)清洗两遍。将琼脂糖朱用SDS-PAGE上样缓冲液洗脱下来并95℃热变性5min,使用SDA-PAGE胶进行蛋白分离并用转膜仪将蛋白转移到PVDF膜上。将转好的膜用PBST(PBS,0.1%Tween-20)溶解的含5%脱脂奶粉的封闭液进行封闭2h,并在4℃孵育一抗过夜。在用PBST清洗后,用含辣根过氧化酶的二抗进行孵育2h后再用PBST清洗后进行爆片。蛋白交联实验将HCC827细胞共转染EPAS1和野生型或突变型T790M EGFR后收集细胞并在4℃冰冻离心机中800g离心10 min并用PBS重悬。将交联剂用DMSO溶解后备用并将其加入到细胞悬液中使终浓度为0.1m M,在4℃孵育2 h。使用RIPA裂解液进行理解并进行蛋白免疫沉淀反应。蛋白使用添加DTT或未添加DTT的SDS-PAGE上样缓冲液进行洗脱并进行蛋白免疫印迹。RNA干扰和荧光定量PCR为了进行RNA干扰实验,靶向MET的慢病毒载体sh RNA V2LHS_113750和V3LHS_318637购自GE Dharmacon公司。细胞使用慢病毒转染体系并用1μg/ml嘌呤霉素进行筛选得到稳定敲低的细胞株。为了检验干扰效率我们提取了细胞的总RNA并使用全式金Easy Script Reverse Transcriptase反转1μg总RNA,同时使用GAPDH m RNA水平进行标准化并将所有基因表达量展现为相对值。细胞增殖,生长和存活分析细胞生长使用MTT法进行分析。细胞使用TKIs处理72 h后进行检测并标准化为空白组的表达。克隆形成实验用来检测细胞生长情况。所有浓度的药物处理经过五次单独的检测并展示为平均值±标准误。数据分析所有的数据都展示为平均值±标准误。使用双尾检测的T检验来检测两组之间的差异,当p
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