01)水平均低于老年对照组,小剂量组的TC(P＜0.05)、LDL-C(P＜0.01)水平低于与老年对照组,两个他汀组的HDL-C水平与老年对照组无差异(P＞0.05),大剂量组降低TC和LDL-C的作用较小剂量组更显著(P＜0.05);他汀组的脂褐素、β-半乳糖苷酶、MDA含量较老年对照组均显著降低,CAT、NOS、SOD活性均显著增高(P＜0.01)。3.老年大鼠心肌IL-1β、TNF-α和MMP-9的mRNA和蛋白表达水平均较青年大鼠显著增加(P＜0.01);他汀组的IL-1β、TNF-α和MMP-9的mRNA和蛋白表达水平均较老年大鼠显著降低(P＜0.01);大剂量组的作用更显著。4.老年大鼠心肌PPARα、PPARβ/δ和PPARγ三个亚型在mRNA和蛋白水平的表达均较青年组明显降低(P＜0.01);他汀组心肌PPARα、PPARβ/δ和PPARγ三个亚型在mRNA和蛋白水平的表达均较老年大鼠显著增高(P＜0.01)。5.分离培养的老年大鼠心肌细胞的研究中发现,溶剂对照组与空白对照组IL-1β、TNF-α和MMP-9的mRNA和蛋白表达水平均无显著差异(P＞0.05);阿托伐他汀组IL-1β、TNF-α和MMP-9的mRNA和蛋白表达水平均显著低于空白对照组(P＜0.01);PPARs拮抗剂加他汀组IL-1β、TNF-α和MMP-9的mRNA和蛋白表达水平均高于阿托伐他汀组(P＜0.05)。
结论:1.老年大鼠的老化指标如血压、血脂水平,心肌肥厚程度、心肌胶原比例,心肌细胞凋亡数,衰老特异性β-半乳糖苷酶、MDA含量,CAT、NOS、SOD活性等均较青年大鼠有显著改变,阿托伐他汀干预可逆转上述改变。2.老年大鼠心肌炎性因子IL-1β、TNF-α和MMP-9的表达显著增强,阿托伐他汀可抑制上述炎性因子在心肌的表达。3.老年大鼠心肌PPARα、PPARβ/δ和PPARγ三个亚型的表达水平均显著降低,阿托伐他汀干预可上调老年大鼠心肌PPARs三个亚型的表达水平。4.阿托伐他汀抑制老年大鼠心脏炎性因子IL-1β、TNF-α和MMP-9表达的作用机制至少部分与其激活PPARs途径有关。
Egr-1与骨桥蛋白在大鼠血管平滑肌细胞中的相关性及其机制的研究 点击此处 前言 动脉粥样硬化性疾病、血管重建术后再狭窄(restenosis,RS)、高血压等血管重塑相关性疾病已经愈来愈严重地威胁着人类的健康。目前认为,血管中膜平滑肌细胞(smooth
muscle cell,SMC)向内膜下迁移与增殖是血管重塑的主要病理基础之一。 研究表明,某些转录因子(transcription factors,TF)可以调节多个血管平滑肌细胞(vascular PLX 4720 smooth muscle cell,VSMC)增殖相关基因的表达,从不同层面调控VSMC的迁移与增殖。同时,人们也逐渐注意到细胞外基质(extracellular matrix,ECM)在血管重塑过程中的重要地位。研究发现,ECM在各种外界刺激的作用下,可以作为细胞外信号,经跨膜信号传递系统到达核内,激活一系列调控VSMC增殖的TF,从而推动VSMC的分裂、迁移及增殖。TF与ECM在血管重塑的过程中密不可分,因此将二者有机地联系在一起,并对其相互作用关系进行深入探讨,将有助于全面了解血管重塑的细胞与分子机制。 早期生长反应因子-1(eally growth response factor-1,Egr-1)作为一种锌指结构TF,参与多种基因的调控,与细胞增殖关系密切。大量研究表明,Egr-1在介导VSMC迁移、增殖过程中发挥着重要的作用,成为目前血管重塑机制研究中的焦点。骨桥蛋白(osteopontin,OPN)作为ECM中一种重要的功能性蛋白,被认为是血管损伤重塑过程中重要的始动因素,应用抗OPN抗体可以抑制VSMC的表型转化、迁移和增殖。尽管Egr-1和OPN在介导VSMC迁移、增殖过程中均起着重要的作用,但二者之间的关系尚不清楚。 本课题拟在以往研究的基础上,对培养的大鼠主动脉VSMCs分别稳定转染Egr-1、OPN基因,并检测转染前后OPN与Egr-1的表达变化,从而分析二者的相关性。并应用染色质免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)方法检测Egr-1与OPN启动子的结合情况,同时通过向OPN稳定转染细胞株中加入细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular
signal-regulated kinase,ERK)的磷酸化抑制剂,检测抑制ERK磷酸化后,OPN上调Egr-1的水平变化,从而对Egr-1与OPN相关性的内在机制进行深入探讨,并为抑制VSMC的迁移、增殖,控制血管壁的不适当重塑提供理论及实验基础。 材料与方法 更多 1、大鼠VSMC的培养 大鼠A10主动脉VSMC细胞株购自ATCC细胞库,用含10%胎牛血清(fetalbovine serum,FBS)的DMEM培养基,在37℃、5%CO_2、饱和湿度的培养箱中培养,用0.25%的胰酶消化、传代。 2、质粒的提纯、扩增及稳定转染 委托TaKaRa公司对pCMV-Egr-1/NEO、pCMV(-)/NEO质粒及pET-28-rOPN/NEO、pET-28(-)/NEO质粒进行提纯、扩增及鉴定,其中pET-28-rOPN/NEO和pET-28(-)/NEO质粒被连于CMV启动子上,以便在VSMC中表达。 待培养的VSMCs生长到80%汇合度时,以100μg/ml～1mg/ml的新霉素(neomycin418,G418)浓度进行最低G418浓度筛选。当培养的VSMCs在6孔板内达到80%汇合度时,应用FuGENE6分别向VSMCs内转染pCMV-Egr-1/NEO、pCMV(-)/NEO质粒及pCMV-ET-28-rOPN/NEO、pCMV-ET-28(-)/NEO质粒。细胞转染24小时(hour,h)后,加入400μg/ml G418的培养液进行培养。2周后,采用有限稀释法将细胞传至96孔板中进行单克隆化培养(于含200μg/ml G418的条件培养液中),待长满后进行扩大培养,并检测细胞中Egr-1、OPNmRNA的表达。 3、应用ERK磷酸化抑制剂阻断ERK信号传导通路 当OPN稳定转染的VSMCs生长至80%汇合度时,向细胞培养液中加入10μMERK磷酸化抑制剂PD98059,继续培养24h后,进行Western blot检测。 4、反转录多聚酶链反应(reverse transcriptase polymerase chainreaction,RT-PCR)检测Egr-1、OPNmRNA 用Trizol Reagent提取VSMCs的总RNA。用RNA PCR Kit Ver.3.