05或p<0.01),但是肾重与体重比值略有降低(p<0.01)。与糖尿病组(diabetesgroup)相比,糖尿病治疗组(pp2group)的体重、摄食量略有升高(p<0.01),肾重、肾重与体重的比值以及24h尿量明显下降(p<0.05或p<0.01)。(2)与正常对照组(controlgroup)相比,糖尿病组(diabetesgroup)的血糖、血清肌酐、尿素氮、甘油三酯、低密度脂蛋白和24h尿白蛋白明显升高(p<0.01)。与糖尿病组(diabetesgroup)相比,糖尿病治疗组(pp2group)的血糖、血清肌酐、尿素氮和24h尿白蛋白均明显下降(p<0.05或p<0.05或p<0.05或p<0.01);p38mapk活性在高糖刺激12h开始升高,至少持续48h以上(p<0.05或p<0.05或p<0.01)。与hg组相比,sb203580(hg+sb203580组)能够明显降低pparγ、chop蛋白质表达(p<0.01)。(2)与ng组相比,高糖培养(hg组)hk-2细胞48h的egfr磷酸化水平(活性)明显升高(p<0.01)。与hg组相比,pp2(hg+pp2组)能够明显降低egfr磷酸化水平(活性)(p<0.01)。ng组和m组之间的egfr磷酸化水平(活性)无显著差异。(3)与ng组相比,高糖培养(hg组)hk-2细胞48h的egfr磷酸化水平(活性)明显升高(p<0.01)。与hg组相比,ag1478(hg+ag1478组)能够明显降低egfr磷酸化水平(活性)(p<0.01)。与HG组相比,AG1478(HG+AG1478组)能够明显降低GRP78和CHOP蛋白质表达(P<0.05或P<0.01)。与HG组相比,EGFR抑制剂AG1478明显改善高糖对细胞活性的抑制作用(P
Wip1(Wild

所以 type p53-induced protein phosphatases,野生型p53诱导的蛋白磷酸酶1)隶属于苏氨酸/丝氨酸PP2C蛋白家族,在脑胶质细胞瘤、乳腺癌、膜腺神经内分泌肿瘤等多种恶性肿瘤中均有异常表达,是一种新发现的原癌基因。研究表明Wip1基因的表达依赖于p53蛋白的活化,而其Wip1蛋白的过表达能使活化的p53蛋白去磷酸化和减少p53基因选择性突变,从而发挥其原癌基因功能。乳腺癌、脑胶质细胞瘤等恶性肿瘤中Wip1的异常表达能影响患者预后并提高肿瘤对抗癌药物的耐受性。但目前关于Wip1与宫颈癌的相关研究较少,特别在宫颈癌的辐射敏感性方面还未有报道。基于现状,本研究以Wip1为切入点,首次探讨Wip1对宫颈癌He

La细胞生物学行为和辐射敏感性的影响,并阐明相关分子机制,以期为Wip1作为宫颈癌的放疗增敏靶点提供实验基础和理论支持,也为宫颈癌患者的个性化治疗提供新的治疗靶点。目的:阐述干预Wip1基因在增强宫颈癌细胞系He La细胞的辐射抗性过程中的作用及其机制,并探讨干预Wip1在宫颈癌治疗过程中的作用方法:(1)本研究采用的照射条件为:GC3000 Elan辐射器(MDS Nordion,加拿大),单次受照剂量2~3 Gyγ-射线。(2)应用Western bolt法检测不同宫颈癌细胞株中Wip1表达水平;(2)MTT法检测不同细胞株细胞增殖活性;(3)分别构建pc DNA3.1-Wip1和si RNA-Wip1重组质粒,将其转染入人宫颈癌细胞系He BI 2536分子重量 La细胞,构建空载体细胞、si

Wip1细胞和si Wip1+过表达Wip1细胞;(4)实时定量PCR法检测稳定转染细胞Wip1 m RNA表达量;(5)Western blot法检测稳定转染细胞Wip1蛋白表达量;(6)平板克隆形成实验检测He 许多 La细胞的放射敏感性;(7)流式细胞仪检测He La细胞凋亡水平;(8)彗星实验检测细胞在γ线照射后不同时间He La细胞的DNA片段分布,观察He La细胞的DNA损伤、修复情况;(9)Western blot法检测He La细胞p38,p-p38,p53和p-p53表达水平;(10)采用p38MAPK抑制剂SB203580预处理He La细胞,评价p38MAPK信号通路与He La辐射敏感性的关系;(11)应用Image J软件对蛋白电泳条带做灰度分析;(12)Student’s t-test用于分析数据,p0.05)。3、沉默Wip1表达上调He La的辐射敏感性si Wip1细胞于转染后48 h起增殖速度显著降低并呈下降趋势,其72 h、96h细胞数目显著低于空载体细胞和si Wip1+过表达Wip1细胞,差距有统计学意义(P0.05);克隆形成数目和半径结果与之类似;细胞凋亡水平与之相反。联合γ-射线辐射时,si Wip1细胞克隆数目和克隆半径显著低于空载体细胞和si Wip1+过表达Wip1细胞,差距有统计学意义(P0.05);细胞凋亡水平与之相反。4、沉默Wip1表达下调辐射条件下He La细胞的DNA损伤修复与空载体细胞和si Wip1+过表达Wip1细胞相比,si Wip1细胞DNA损伤程度较重,表现在彗星头部DNA百分比明显减少,而彗星尾部的小片段破损DNA百分比明显升高,差距有统计学意义(P0.05)。5、Wip1与p38MAPK信号通路中蛋白表达相对于空载体细胞和si Wip1+过表达Wip1细胞,si Wip1细胞p-p38、p53和p-p53的表达水平显著降低(P<0.05,P<0.01,P0.05)。而三组细胞中p38表达水平没有显著差别(P>0.05)。当预处理SB203580时,si Wip1+SB20358细胞相对于si Wip1细胞p-p38、p53和p-p53的表达水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01,P0.05),三组细胞p38水平没有显著差别(P>0.05)。6、SB203580逆转Wip1提高了细胞的辐射敏感性当预处理SB203580时,si Wip1+SB203580细胞和空载体细胞的克隆数目、克隆半径和凋亡水平相近,差异没有统计学意义(P>0.05);当联合γ-射线辐射时,si Wip1+SB203580细胞和空载体细胞的克隆数目、克隆半径和凋亡水平同样相近(P>0.05),表明SB203580逆转沉默Wip1能提高细胞的辐射敏感性。结论:1.Wip1在宫颈癌He La细胞的放疗敏感性中发挥重要的调节作用,沉默Wip1表达可以使γ-射线辐射后He La细胞细胞增殖、克隆形成和抗凋亡能力降低;2.Wip1能增强γ-射线辐射所引起的He La细胞DNA损伤的修复,从而增强其放疗耐受性;3.