25或0.5mg·kg~(-1)）持续一周，每天五次，于第八天，B、C、D、E组小鼠腹腔注射MPTP-HCl，一天四次，每次20mg·kg~(-1)，间隔2h，总量为80mg·kg~(-1)。造模当天，继续给予烟碱，剂量、次数不变，前四次在给予MPTP前30分钟给药，第九天继续腹腔注射烟碱（0.25或0.5mg·kg~(-1)）持续一周，每天五次，对照组小鼠给予相同剂量的生理盐水。α7-nAChRs特异性的阻断剂MLA在给予烟碱前20-30分钟给药，一天两次。免疫组织化学法检测脑SNpc区DA能神经元的存活（TH染色），同时检测黑质部位星形胶质细胞的活化（GFAP染色）。应用RT-PCR和Western

blotting检测原代培养的小鼠星形胶质细胞上α7-nAChRs的表达；ELISA法检测细胞培养液中TNF-α的含量；Western blotting检测星形胶质细胞内Erk1/2和p38磷酸化水平。 结果：我们发现Nicotine可明显改善PD模型小鼠的行为学变化，减少SNpc区多巴胺神经元的损伤及黑质区星形胶质细胞的活化，其机制与Nicotine激活α7-nAChRs有关，应用原代培养的星形胶质细胞进一步深入探讨激活α7-nAChRs的神经保护机制，发现MPP+和LPS可显著诱导星形胶质细胞活化，致炎因子TNF-α生成增加，Nicotine预处理能显著抑制星形胶质细胞的活化，抑制TNF-α的释放，机制与Erk1/2和p38MAPK信号通路有关，选择性α7-nAChRs阻断剂MLA可逆转Nicotine的上述效应。

Docetaxel 价格 结论：Nicotine能够显著缓解MPTP诱导的小鼠帕金森样症状，促进黑质多巴胺能神经元存活，其神经保护作用机制与通过α7-nAChRs抑制星形胶质细胞活化介导的神经炎性反应相关。 第三部分α7-nAChRs在中脑腹侧被盖区多巴胺神经元上的电生理学机制研究 目的：研究VTA多巴胺神经元表达的α7-nAChRs等烟碱受体亚型的功能特点。 方法：应用多巴胺神经元急性分离技术、穿孔膜片钳技术和U管快速给药系统，观察VTA多巴胺神经元表达的α7-nAChRs等烟碱受体亚型的功能特点。 结果：根据全细胞电流动力学及药理学特点，我们将VTA区nAChRs分为ID、IID、IIID型受体。动力学分析揭示ID和IID型受体可被快速激活及衰减，而IIID型受体则相对较慢。药理学分析揭示ID型受体介导的电流对α4β2-nAChRs特异的激动剂RJR-2403和拮抗剂DHβE敏感，IID型受体介导的电流对α7-nAChRs特异的激动剂choline和拮抗剂MLA敏感，而IIID型受体介导的电流对含β4的nAChRs特异的激动剂cytisine和拮抗剂MEC敏感。IID型受体激动剂EC50明显高于ID和IIID型受体，表明其对激动剂的亲合力较低。

没有 结论：VTA多巴胺神经元表达多种不同的功能性nAChRs，有趣的是，每个多巴胺神经元似乎只有一种nAChRs亚型，该研究深化了α7-nAChRs在PD中枢神经系统功能的认识，丰富了α7-nAChRs研究的神经生物学内容。综上所述，本文工作的主要创新之处在于： 1.揭示了Nicotine对MPTP制备的PD模型鼠具有显著的神经保护作用，其机制与抑制星形胶质细胞活化及神经炎性反应相关，α7-nAChRs在其中发挥关键作用，为PD的治疗提供了新的思路，为研发靶向于α7-nAChRs的抗神经炎性保护剂提供了新的理论依据。 Seliciclib化学结构 2.通过膜片钳技术就VTA多巴胺神经元表达的α7-nAChRs等烟碱受体亚型进行功能学分类，为探索α7-nAChRs的神经保护作用及其机制积累必要的实验与学术基础。
非同位素均相生化检测方法广泛应用于蛋白激酶抑制剂的筛选已经有十年以上时间,这些方法各有自身的优缺点,如何根据酶的性质以及研究需要选择一种适合研究的方法是酶学家要面对的一个问题。此外,由于激酶本身的多样性,至今没有任何均相的非同位素方法能够对所有518种激酶进行活性检测和分析,因此进行激酶酶谱筛选时,需要至少使用两种以上的分析方法组合进行激酶酶谱筛选,报导其抑制率IC50值。由于这些检测方法的原理有很大不同,同时其使用的酶量、ATP浓度、缓冲液的成分、反应时间、温度要求等条件也不竞相同,因此,如何进行几个方法间的数据整合、比较变成一个非常亟待解决的问题。本文选取了14种现有的激酶以及八个已经为人们熟知的激酶抑制剂作为研究对象,使用下列五种不同原理的激酶检测方法ADP-Glo, Htrf, LanthaScreen Binding, Mobility Shift和Z-lyte这些已经在世界上广泛应用的方法进行活性检测和分析,以判断其适用范围以及其各自特点。 首先,本研究证明这些方法虽然各自有不同的特点,但其Z因子均大于0.

36mmo.lL-1过氧化氢作用1h,造成髓核细胞的氧化应激模型;阻断组以p38MAPK抑制剂预处理髓核细胞30min后,再按照模型组造成氧化应激模型。各组经上述处理后继续培养48h,进行髓核细胞形态学观察,同时检测髓核细胞增殖率、β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)活性及细胞周期,最后进行组间比较分析。[结果]各组髓核细胞形态未出现显著变化,但模型组和阻断组的细胞分布密度较稀疏、并有典型衰老改变,主要表现为:细胞增殖减慢、衰老相关β-半乳糖苷酶蓝染率增加、细胞周期阻滞于G1期等(与空白组相比P<0.05)。其中模型组衰老程度最为严重,阻断组则抑制了部分衰老改变(与模型组相比P<0.05)。[结论]p38MAPK信号转导通路是介导氧化应激诱导兔髓核细胞衰老和凋亡过程的关键通路之一。
炎症因子的表达调控是炎症反应的关键步骤,与自身免疫疾病以及癌症等密切相关.一氧化氮(nitric

MAPK Inhibitor Library supplier oxide,NO)在炎症因子表达调控中具有重要作用,但已有的研究多关注于NO合成对炎症因子的调控作用,而对NO代谢的作用知之甚少.亚硝基化谷胱甘肽还原酶(S-nitrosoglutathione reductase,GSNOR)是体内NO信号通路代谢调控的关键蛋白.本研究发现脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)在RAW264.7细胞中上调诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)的同时下调GSNOR的转录和蛋白质表达,该下调作用依赖MEK1/2、p38和PI3K信号通路.抑制GSNOR可促进LPS诱导的炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α表达,而过表达GSNOR作用相反.抗炎症药物曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA)能够挽回LPS对GSNOR的下调作用,并且GSNOR抑制剂削弱了TSA对炎症因子IL-6和TNF-α转录的抑制效应.这些结果表明:GSNOR是一个新的重要炎症调控分子,它可能成为调控NO介导的炎症相关信号通路的新的潜在靶点,上调GSNOR可能是抑制炎症的新思路.本研究揭示了巨噬细胞通过上调iNOS和下调GSNOR共同增强免疫炎症反应的新机制,拓展了对NO代谢在炎症反应中作用机制的认识.
流感病毒(influenza INCB018424研究购买 virus)属于正黏病毒科(Orthomyxoviridae family)流感病毒属。根据流感病毒的核蛋白(nucleoprotein,NP)和基质蛋白(matrix

protein,M)抗原性的不同将其分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型,其中甲型流感病毒根据其表面的血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)抗原性的差异,又分为16种HA亚型和10种NA亚型[1]。
通过猪链球菌2型分解代谢控制蛋白A(catabolite

control protein A,ccpA)原核表达蛋白对巨噬细胞RAW264.7进行刺激,结果发现,猪链球菌2型ccpA蛋白可以调节巨噬细胞NO产生,另外该蛋白质可通过对iNOS、NF-κB、p38和ERK1/2MAPK等的调节,从而影响巨噬细胞RAW264.7对细胞因子IL-6、TNF-α和IFN-γ的分泌。该研究为类似蛋白质对免疫细胞NF-κB/MAPK等通路调节影响及细胞因子产生条件探索建立了基础。
在糖尿病肾病(diabetic Tubacin nephropathy,DN)的发展过程中,炎症相关信号通路———p38丝裂原活化蛋白激酶(mito-gen-activated protein kinase,MAPK)通路与肾组织损伤密切相关。一方面,高血糖、血流动力学异常、氧化应激以及前炎症因子等多种因素在上游激活p38MAPK信号通路;另一方面,活化的p38MAPK信号通路进一步诱导下游炎症细胞活化,促进炎症介质表达,增加炎症因子产生,最终,导致肾组织炎症性损伤。中药对p38MAPK信号通路的干预作用是通过多途径实现的,主要包括抑制炎症因子表达、调节磷酸化p38MAPK(phosphorylated p38MAPK,p-p38MAPK)表达、减少致纤维化因子表达等。
目的探讨胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)在化学性缺氧损伤PC12细胞中的作用。方法应用化学性低氧模拟剂氯化钴(CoCl2)处理PC12细胞建立化学性缺氧损伤模型。应用细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)比色法检测细胞存活率;罗丹明123(Rh123)染色荧光显微镜照像检测线粒体膜电位(MMP);流式细胞术检测凋亡细胞百分比;Western blot法测定caspase-3、ERK1/2和p38MAPK蛋白的表达水平。结果应用600μmol.L-1处理PC12细胞60 min可使磷酸化(p)ERK1/2的表达明显升高;在600μmol.L-1CoCl2处理PC12细胞前,应用500μmol.L-1N-乙酰半胱氨酸(NAC,为活性氧的清除剂)预处理1 h可抑制CoCl2对p-ERK1/2表达的上调作用;在600μmol.L-1CoCl2处理PC12细胞前,应用10μmol.L-1U0126(ERK1/2抑制剂)预处理2 h可保护PC12细胞对抗CoCl2引起的损伤,使细胞存活率升高,凋亡细胞数目和cleaved caspase-3表达及线粒体膜电位(MMP)丢失均减少;10μmol.

为了进一步阐明其信号传导途径,应用多种信号抑制剂,采用免疫印迹、Boyden小室和提取细胞膜蛋白等实验方法,对上述迁移作用的信号传导途径进行了深入的研究.结果显示,PTX(Gi蛋白抑制剂)、U73122(PLC抑制剂)、staurosporine(PKC抑制剂)、PD98059(ERK1/2抑制剂)和SB203580(p38抑制剂)分别可拮抗上述AA诱导的SM3细胞迁移作用,而SP600125(JNK抑制剂)的作用较弱.免疫印迹结果显示,AA可提高SM3细胞中PKC(ε)、ERK1/2、p38和JNK信号的磷酸化水平,呈时间依赖性,PTX或U73122可抑制上述作用;staurosporine可抑制由AA引起的ERK1/2和JNK的磷酸化水平增强,但对p38的磷酸化水平无影响.还发现AA可促进PLCβ2的细胞膜移位,PTX可抑制其作用.上述结果表明,当肌球蛋白轻链的磷酸化被抑制后,AA可通过Gi蛋白的活化促进PLCβ2向细胞膜移位,进而通过激活PKC(ε)、ERK1/2、p38和JNK等信号转导途径而诱导SM3细胞发生迁移.
背景:牙周膜细胞对于维持牙周组织的形态和功能起着关键作用,不良应力可能引起其合成过量炎症因子从而最终引起牙周组织破坏。目的:分析p38丝裂原激活蛋白在压力诱导人牙周膜成纤维细胞合成炎症因子白细胞介素6过程中所起的作用。设计:观察对比实验。单位:解放军第四军医大学口腔生理实验室。材料:牙周膜成纤维细胞:取自因正畸需要拔除的20颗健康恒前磨牙的12～16岁青少年牙根中1/3牙周膜组织。试剂和仪器:白细胞介素6ELISA试剂盒(第四军医大学免疫学教研室);酶联免疫检测仪(华东电子管厂);p38p38丝裂原激活蛋白阻断剂特异阻断剂SB203580(Biochemical公司生产,第一军医大学病理生理教研室姜勇教授惠赠)。方法:采用常规组织块法将牙周膜组织细胞进行原代培养至第4、5代,将细胞随机分为4组:加压对照组:不对细胞加压及预处理;加压组:以200kPa持续加压细胞,不加预处理;预处理对照组:细胞加压前1h上清中加入10g/L二甲基亚砜,加压方式、时间同加压组;预处理组:细胞加压前1h预处理,即在上清中加入p38丝裂原激活蛋白阻断剂的特异阻断剂SB203580,浓度为1μmol/L,加压方式、时间同加压组。各组分别在持续加压后16,24h采集标本,通过酶标记免疫吸附测定法测定不同时间点各组细胞中白细胞介素6表达量。主要观察指标:压力对人牙周膜成纤维细胞产生的白细胞介素6的量的影响结果及p38丝裂原激活蛋白阻断剂对压力诱导人牙周膜成纤维细胞产生的白细胞介素6量的影响结果。结果:加压组细胞经持续加压16,24h后的白细胞介素6表达量分别为(143.1±0.42),(49.46±1.01)ng/L,明显高于加压对照组[(18.36±0.43),(18.78±0.50)ng/L,P<0.05]。结论:p38丝裂原激活蛋白是机械压力诱导人牙周膜成纤维细胞产生白细胞介素6的重要环节。
目的:探讨肝细胞生长因子/离散因子(HGF/SF)在大肠癌细胞体外侵袭中的作用。方法:用细胞迁移系统分析HGF、PD98059和SB203580处理的大肠癌细胞Caco-2和Colo320体外迁移能力;用逆转录聚合酶链反应检测Caco-2细胞中MMP-2、MMP-9及其抑制因子TIMP-1、TIMP-2的mRNA表达。结果:HGF对Colo320细胞迁移无影响。细胞培养48

JNK 抑制剂 h后,Caco-2细胞迁移数HGF组和PD98059组与对照组比较、HGF组和PD98059组比较,差异显著[对照组(104.40±4.77/)ml,HGF/SF组(126.80±5.40/)ml,PD98059组(82.80±4.15/)ml,P
目的探讨包被磁珠的人视网膜色素上皮(RPE)细胞在受磁场作用时丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路的变化。方法将胶原包被的磁珠悬液加入体外培养的人RPE细胞后孵育,附着磁珠的细胞放置在恒定磁场中。用免疫印迹法检测MAPK的细胞外信号调控激酶(ERK)、c-jun氨基端激酶(JNK)及p38信号分子在3~30min时间段的表达情况和p38特异性阻断剂(SB203580)的干预作用,用免疫荧光染色法观察活化型p38的表达变化。结果在RPE细胞中,总ERK、JNK及p38均有表达,活化型ERK、p38亦有表达,活化型JNK未见表达。活化型ERK的表达无明显变化,而活化型p38在受磁场作用前表达量很低,但作用5min后即显著增高。吡啶异咪哒唑类化合物SB203580可以抑制牵拉作用造成的p38磷酸化。免疫荧光染色也显示牵拉刺激可以增加活化型p38的荧光量。结论磁场可以对包被磁珠的RPE细胞产生作用,部分作用可能通过p38信号转导途径产生。
目的探讨降钙素基因相关肽(CGRP)对角质形成细胞表达和分泌血管内皮生长因子(VEGF)的调控。方法用实时定量PCR(RT-PCR)方法检测CGRP、CGRP1型受体拮抗剂CGRP8-37、细胞外信号调节激酶ERK1/2特异性的抑制剂PD98059、p38MAPK特异性拮抗剂SB203580对HaCaT角质形成细胞表达VEGF

不 selleck激酶抑制剂 mRNA水平的影响;用酶联免疫吸附方法检测HaCaT细胞分泌至培养液中VEGF蛋白的水平。结果CGRP时间依赖性地促进HaCaT细胞表达VEGF mRNA和分泌VEGF蛋白; CGRP8-37和PD98059均可明显抑制CGRP刺激的HaCaT细胞表达和分泌VEGF,SB203580不能减弱CGRP刺激的VEGF表达和分泌。结论CGRP可以上调HaCaT细胞表达和分泌VEGF,CGRP1型受体及其相关的ERK1/2信号通路参与其调控。
Aim:To observe the effects of sodium ferulate (SF) on amyloid beta (Aβ)_(1-40)-induced p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) signal transduction path-way and the neuroprotective effects of SF.Methods:Rats were injectedintracerebroventricularly with Aβ_(1-40).

免疫组化和TUNEL实验 免疫组化和TUNEL实验用来分析双向PI3K/mTOR抑制剂联合辐射对肿瘤组织通路各蛋白变化的影响。免疫组化标本来源于5-8F小鼠移植瘤模型,组织切片厚度5mm。组织切片先在4%多聚甲醛中固定过夜,再用石蜡包埋。脱蜡和水化后,切片加入含有10mM柠檬酸钠缓冲液中,置于微波炉中20分钟,进行抗原修复。然后,组织切片用一抗4℃孵育过夜,再加入二抗室温下孵育1小时。最后用苏木素和染色,并在显微镜下观察及拍照。每张切片至少观察3个随机视野。TUNEL实验参照Promega公司的凋亡检测试剂盒说明书进行。 查找协议 10.统计学分析 本实验中所有的数据均采用均数±标准差表示,每个实验至少重复3次。均数间比较采用双侧t检验(two-tailed unpaired student’s t-test)或完全随机设计资料的方差分析(one-way

ANOVA)。在体内实验中,研究药物与辐射的协同抗肿瘤效应,采用析因分析。P<0.001,PPKI+RT<0.001；5-8F:PGSK+RT<0.05)或PKI-587(P
近10年来，肺癌已经逐渐从“one fits all”的治疗模式过渡到以分子标志为指导的个体化治疗，其中驱动基因为分子标志的靶向治疗有了更为显著的进展。EGFR （Epidermal growth factor receptor）、 EML4-ALK （Echinodermmicrotubule-associated protein-like4and anplastic lymphoma kinase）、 KRAS（v-Ki-ras2Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog）是肺腺癌最重要的三个驱动基因。第一个以驱动基因为靶点的成功范例是EGFR TKIs（Tyrosine kinaseinhibitor）治疗EGFR突变患者的有效率达70%，疾病无进展生存期（progression-free survival，PFS）也显著延长，使得肺癌的治疗模式发生了革命性的改变，第二个成功的范例是克唑替尼治疗ALK阳性患者的有效率约60%，2年生存率达50%，也显著优于传统的化疗疗效。

研究已证实EGFR突变是EGFR TKIs疗效和PFS最强的预测因素，但EGFR突变是否为非小细胞肺癌患者的预后预测因子仍存在争议。EML4-ALK是一个新的驱动基因，它与患者临床病理特征的研究结果并不一致，原因有各研究采用的方法不同、研究人群不同、样本量不够大，有的研究人群经过筛选等，在大样本随机患者中筛查EML4-ALK重排的研究很少，尤其是在中国肺腺癌患者中的研究更为少见，此外，探讨ALK重排在肺癌患者的预后意义的研究也很少报告。EML4-ALK融合基因的检测方法有三种，荧光原位杂交（Fluorescence 因为 in situhybridization，FISH）、免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）、逆转录聚合酶链反应（Reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR），三种方法各有优缺点，在大样本患者中比较三种方法的研究较少。KRAS是最早发现的驱动基因，尚无理想的靶向药物，KRAS对预后的预测价值也存争议。 针对以上的问题，我们设计在大样本随机肺腺癌患者中筛查EGFR、EML4-ALK、KRAS三个驱动基因，探讨三个基因与肺腺癌患者的临床特征、治疗疗效及预后的关系，并探讨FISH、Ventana IHC、RT-PCR方法检测ALK重排的作用，对临床个体化治疗具有非常重要的指导意义。 包括三部分内容： 第一部分：检测430例肺腺癌患者的EGFR基因状态，分析EGFR状态与临床病理特征、治疗疗效及预后的关系。430例患者中，186例（43.3%）患者携带EGFR突变；女性EGFR突变高于男性，不吸烟患者高于吸烟患者；三种主要腺癌亚型中，乳头状为主型EGFR突变率高于腺泡样为主型和实体型为主腺癌；EGFR状态与化疗疗效无关，EGFR突变是EGFR

TKI（sTyrosine kinase inhibitors）疗效的预测因子；多因素分析显示EGFR突变是预后独立因素，EGFR突变患者预后优于野生型患者。 第二部分：检测430例肺腺癌患者的ALK重排状态，分析ALK重排与临床病理特征、治疗疗效及预后的关系，并评价FISH、Ventana Selleck Natural产品 Library IHC及RT-PCR三种方法检测ALK重排的作用。430例患者中，ALK阳性率为10.7%，年轻患者中多见，实体型为主腺癌和腺泡样为主型多见，EGFR野生型患者中多见。ALK重排与性别、吸烟状态、分期无关。ALK阳性患者对EGFR TKIs无效，ALK状态与化疗疗效及预后无关。采用FISH和Ventana IHC检测430例患者ALK状态，采用FISH、Ventana IHC和RT-PCR检测200例患者，Ventana IHC和FISH一致性好，敏感性和特异性分别为100%、98.2%，与FISH一致性为98.4%。RT-PCR的敏感性和特异性分别为95.7%、87.0%，与FISH的一致性为89.0%。三种方法检测结果显示RT-PCR敏感性更高。 第三部分：检测332例肺腺癌患者的KRAS状态，分析KRAS基因状态与临床病理特征、治疗疗效及预后的关系。332例患者中，24例（7.2%）携带KRAS突变，吸烟患者KRAS突变率高于不吸烟患者。KRAS不能作为判断TKI疗效、化疗疗效及预后的预测因子。332例肺腺癌患者EGFR、ALK、KRAS的频率分别为44.9%、9.6%、7.2%，肺腺癌患者三种基因的异常共计60.

00mg/L）培养基RPMI-1640。D组：为转染shRNA质粒干扰+胃泌素组，4-6小时后换含胃泌素（25.00mg/L）培养基RPMI-1640，再培养24h。由上海吉凯基因构建p38MAPK-shRNA,转染后观察转染效率，当转染效率达到30%或以上。接着使用流式细胞仪各组细胞增殖；再用Westernblot法检测各组细胞中P38蛋白的表达水平。

Selleck Apoptosis Compound Library 结果： SW480细胞中存在CCKBR mRNA表达。胃泌素在6.25~200.00mg/L范围内能抑制大肠癌SW480细胞的凋亡，且当浓度达25.00mg/L时为最佳浓度（P<0.05）。转染24小时后，观察荧光表达的细胞得出转染效率，当质粒与脂质体的质量比为1:2时转染效率为40%-50%之间。质粒干扰+胃泌素组(D组)细胞增殖指数为(26.47±1.24)%，显著高于空白对照组（A组）的(24.34±0.67)%和阴性干扰组(B组)的(24.18±1.43)%（P<0.05），胃泌素组(C组)细胞增殖指数为（26.39±1.15）%，显著高于空白对照组(A组)和阴性干扰组(B组)（P0.05），空白对照组(A组)和阴性干扰组(B组)比较也无明显差异。利用Western-blot检测四组p38蛋白表达水平存在差异（P<0.01）。在胃泌素组(C组)和质粒干扰+胃泌素组(D组)中表达水平低于空白对照组(A组)（P<0.01），也低于阴性干扰组(B组)（P0.05），胃泌素组(C组)和质粒干扰+胃泌素组(D组)之间的蛋白差异无统计学意义（P>0.05）。 结论：胃泌素能够促进体外大肠癌SW480细胞增殖，同时p38蛋白的表达明显降低，而通过质粒干扰p38蛋白的表达后，大肠细胞SW480的增殖明显增强。进一步论证了胃泌素通过p38信号通路实现对大肠癌细胞SW480的生长调控。
目的研究在炎症因子肿瘤坏死因子-α Selleck BIBR1532 (tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)刺激下施万细胞中β-1,4-半乳糖基转移酶Ⅰ(β-1,4-Galactosyltransferase Ⅰ,β-1,4-GalT Ⅰ)的表达改变,探讨其在TNF-α自分泌、细胞增殖及凋亡中的作用及其机制。 方法 1.为了研究β-1,4-GalT Ⅰ在施万细胞TNF-α自分泌中的作用,运用50ng/mL重组的大鼠TNF-α刺激体外培养及纯化的大鼠施万细胞,运用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,

ELISA)检测施万细胞TNF-α自分泌的改变,逆转录-多聚酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)及Western blot检测TNF-α诱导β-1,4-GalT Ⅰ的表达及细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK1/2)、Jun氨基末端激酶(Jun N-terminal kinase, JNK)和p38信号转导通路的激活情况,同时用中和性抗体阻断TNFR1/2的功能,检测其对TNF-α诱导的β-1,4-GalT Ⅰ表达及TNF-α自分泌的影响；在此基础上在施万细胞中分别转染β-1,4-GalT Ⅰ干扰及过表达质粒,分析干预β-1,4-GalT Ⅰ的表达对施万细胞ERK、JNK和p38信号转导通路激活及其介导的TNF-α自分泌的影响。 2.为了探讨β-1,4-GalT

Ⅰ在TNF-α诱导的施万细胞增殖及凋亡中的作用,运用不同溶度(0、0.001、0.01、0.1、1、10及100ng/mL)的重组大鼠TNF-α处理施万细胞,运用MTT分析法,分析施万细胞增殖的情况,运用TUNEL分析法,分析施万细胞凋亡的情况,利用Western blot,检测不同溶度TNF-α诱导β-1,4-GalT 时间 Ⅰ及TNFR1/2的表达变化。在此基础上,利用基因转染方法增加或减少β-1,4-GalT Ⅰ在施万细胞中的表达,检测ERK1/2、p38与JNK活性及施万细胞增殖和凋亡的改变：同时运用中和抗体干预TNFR1/2的功能,分析介导上述效应的改变。 结果 1.施万细胞在50ng/mL重组的大鼠TNF-α刺激24h后,细胞内TNF-α的mRNA水平及培养基中自分泌的TNF-α含量较未处理组明显升高,RT-PCR及Western blot发现胞内β-1,4-GalT Ⅰ的mRNA及蛋白表达水平显著增加。干扰施万细胞中β-1,4-GalT Ⅰ的表达,TNF-α的自分泌较未干扰组显著降低,而过表达β-1,4-GalT Ⅰ后,施万细胞内TNF-α的自分泌显著提高。运用中和抗体阻断TNFR的功能,发现阻断TNFR1可以逆转TNF-α诱导的β-1,4-GalT Ⅰ的表达及TNF-α的自分泌。Western blot显示,TNF-α可以诱导ERK、JNK和p38信号通路的活化,抑制ERK、JNK和p38可以有效地抑制TNF-α的自分泌。干扰β-1,4-GalT Ⅰ的表达可以抑制TNF-α诱导的ERK、JNK和p38信号通路的活化,而过表达β-1,4-GalTⅠ后,TNF-α自分泌显著增加,但可以被ERK、JNK和p38的抑制剂PD98059、SP600125和SB202190所抑制。 2.MTT法测定细胞增殖表明用不同浓度的TNF-α处理施万细胞12h后,在0.

HGF通过与其受体c-Met结合后,激活其信号传导通路,促进人结肠癌细胞株HT-29、Hct-8、Hct-116、DLD-1的细胞生长增殖;同时增强c-Met通路中Akt、mTor、rpS6及Erk的蛋白表达水平;增强细胞的体外侵袭能力。 三.以c-Met为靶点,研发的小分子抑制剂SU11274对人结肠癌细胞株HT-29、Hct-8、Hct-116、DLD-1的细胞周期改变、细胞增殖抑制均有作用,同时存在对药物剂量、时间的依赖性,且对K-ras基因野生型HT-29、Hct-8细胞抑制效果明显优于K-ras基因突变型Hct-116、DLD-1细胞。

四.以c-Met为靶点的SU11274及以MEK为靶点的PD98059联合给药,对人结肠癌K-ras基因突变型Hct-116、DLD-1细胞生长、增殖均有明显的抑制作用,其对细胞增殖抑制明显优于SU11274和PD98059单药作用。
肿瘤转移是一个非常复杂的过程,涉及局部浸润、渗入血管、随血液循环系统转移并在其中存活、移出血管、在新的部位定居并增殖等诸多过程。上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition)在肿瘤转移过程中具有重要地位。通过上皮间质转化,上皮细胞失去了细胞极性,失去与基底膜的连接等上皮表型,获得了较高的迁移与侵袭、抗凋亡和降解细胞外基质的能力等间质表型。在乳腺癌中,上皮间质转化是肿瘤转移的必须步骤。现有的抗肿瘤转移药物的作用机理大都是杀伤肿瘤细胞来减少肿瘤数目。这种杀伤作用对正常细胞也造成了伤害,给病人带来了巨大的痛苦。 查找更多 在这项研究中,我们用4T1细胞系建立了Balb/c小鼠的乳腺癌自发转移模型。在这个模型中,我们发现,五味子乙素可以减少乳腺癌的肺转移灶数目,延长乳腺癌荷瘤小鼠的生存时间。对早期、中期和晚期乳腺癌的手术治疗的同时辅以五味子乙素,均可以使小鼠生存时间延长。病理切片提示,五味子乙素降低了肿瘤细胞对周围肌肉组织的侵袭,使肿瘤细胞之间保持相对紧密的连接,抑制了其向间质细胞形态的转化。免疫组化的结果证明,所有这些现象的原因在于五味子乙素抑制了体内乳腺癌细胞的上皮间质转化过程。 细胞实验证明,五味子乙素抑制了TGF-β引起4T1细胞的形态变化。划痕试验证明,五味子乙素可以降低肿瘤细胞的迁移能力。Transwell实验证明,五味子乙素降低了肿瘤细胞的侵袭能力。免疫荧光实验及Western蛋白电泳实验证明,五味子乙素抑制了4T1细胞的上皮间质转化过程。

Vorinostat半抑制浓度 综上所述,本项研究证明,五味子乙素在体内、体外均可以抑制乳腺癌细胞的上皮间质转化。五味子乙素具有较低的毒性,对正常细胞及肿瘤细胞均没有杀伤作用。目前,临床上尚无此类只作用于肿瘤转移过程的药物。本实验的结果表明,五味子乙素具有巨大的临床应用价值和开发前景。本课题的研究目的在于为五味子乙素临床应用提供理论依据和基础数据。
目的:研究肝细胞生长因子(hepatocyte growth

factor,HGF)对肝细胞癌SMMC-7721的上皮-间叶转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的作用,并对其机制进行探讨。 方法:应用传代细胞培养技术培养SMMC-7721细胞株,采用HGF最佳浓度处理该细胞株,通过Transwell实验、划痕实验、Wester LDN-193189浓度 blot技术研究HGF对肝癌细胞SMMC-7721 EMT的作用;同时,采用PI3K抑制物LY294002 10μmol/L预处理SMMC-7721细胞株,再加入相同浓度的HGF处理该细胞,然后与未经LY294002预处理的HGF作用细胞进行对比研究,探讨PI3K对于HGF作用机制的影响。 结果:(1)划痕实验和Transwell实验显示HGF处理的细胞侵袭和转移能力与未处理细胞相比明显增强,Wester blot结果显示HGF处理的细胞的N-cadherin、MMP-2、MMP-9、Vimentin表达增加,E-cadherin表达减少;(2)LY294002预处理后,细胞不再受HGF的影响,细胞的形态没有明显变化,Transwell实验和划痕实验结果与未经处理的SMMC-7721相同;Wester blot结果显示:细胞的N-cadherin、MMP-2、MMP-9、Vimentin、E-cadherin的表达变化不明显。 结论:1.HGF能够促进SMMC-7721的上皮间叶转化、增强其侵袭和转移能力、降低细胞的黏附能力,这种作用是通过PI3K实现的;2.HGF与受体c-Met结合激活了PI3K,继而引起一系列的细胞内信号传导,促进肝细胞癌SMMC-7721的上皮间叶转化;3.HGF/c-Met系统参与了肝癌的形成,并且在肝癌细胞的侵袭和转移的过程中起重要作用;4.HGF可作为肝细胞癌治疗的一个重要靶点。
目的:应用免疫组化法(SABC)检测PTEN和PI3K在浅表性胃炎、萎缩性胃炎、伴肠化、异型增生、胃癌各组中的表达情况。探讨两者在胃癌的发生、发展中的作用及临床意义,为胃癌的诊断、治疗和预后提供理论依据。 方法:选择临床及病理资料齐全的延安大学附属医院病理科2008~2009年的胃镜及手术活检标本,单纯性浅表性胃炎19例,单纯性萎缩性胃炎11例;浅表伴肠化5例,萎缩伴肠化14例;浅表伴轻度异型增生9例,中度异型增生5例,重度异型增生6例;萎缩伴轻度异型增生11例,中度异型增生3例,重度异型增生3例;高分化胃腺癌13例,中分化胃腺癌11例,低分化胃腺癌17例,粘膜内癌2例。采用SABC法检测各组胃粘膜组织中PTEN和PI3K表达的情况。对实验所得结果采用SPSS17.0统计软件包进行统计学处理。 结果:(1)PTEN蛋白定位于胃粘膜细胞浆,在慢性胃炎阳性表达率94%,异型增生88.9%,胃癌74.4%,差异有显著性(P=0.

89±16.83)/mm2(P
目的:探讨MMP-2、VEGF、CD105、Ki67在小细胞肺癌组织和正常肺组织中的表达情况以及之间的关系,分析其表达与小细胞肺癌生物学行为和预后的关系,为SCLC的临床治疗及预后判断提供理论基础。 方法:收集2004年1月至2009年12月在大连医科大学附属第一医院病理科存档石蜡组织标本且临床资料完整的小细胞肺癌患者42例及肺良性病变旁正常肺组织8例。小细胞肺癌患者中男性35例,女性7例,中位年龄64岁(43～79岁)。采用免疫组化S-P法测定所有病理标本中MMP-2、VEGF、CD105、Ki67的表达情况,并对所有病例进行随访。应用SPSS17.0统计软件进行数据分析,以P0.05)。3、MMP-2、VEGF、CD105表达均与SCLC患者肿块直径、淋巴结转移、远处转移和临床分期有关(P<0.05或P<0.01)。Ki67表达仅与SCLC患者的淋巴结转移有关(P0.05)。4、MMP-2、VEGF的表达均与CD105和Ki67表达显著相关(P<0.05或P<0.01)。5、MMP-2和VEGF的表达呈正相关(P<0.05或P
背景

肺癌的发病率及死亡率均居恶性肿瘤的首位,非小细胞肺癌(NSCLC)约占80%左右。含铂类药物的两联方案是标准的治疗方案,但其有效率仅有20%-35%左右。随着对肺癌分子生物学研究的深入,人们认识到不同的肿瘤有不同的驱动基因和蛋白表达,为肿瘤的分子靶向治疗奠定了基础。 目的 检测甲状腺转录因子-1(TTF-1)、Ki-67在非小细胞肺癌组织中的表达,探讨其临床意义,以期为非小细胞肺癌患者的诊断、治疗和预后评估提供有价值的分子生物学指标。 方法 将郑州大学第二附属医院2007年1月至2010年12月经病理检查确诊的原发性肺非小细胞癌134例患者作为研究对象,采集病例相关的临床病理资料,免疫组织化学法检测的TTF-1、Ki-67表达,采用SPSS17.0统计软件包进行数据分析。 结果 1.肺腺癌组织中TTF-1蛋白表达高达80.9%(55/68),而鳞癌组织中其表达率仅为7.0%(53/57),两者之间存在显著性差异(P=0.001)；Ki-67蛋白表达在肺鳞癌、肺腺癌、肺腺鳞癌无显著性差异(P=0.063)。 Kinase 抑制剂 Library 2.TTF-1蛋白表达率在女性、细胞分化好、较小的肿瘤(最大径≤3cm)及I期、II期患者中较高(P<0.05)；Ki-67蛋白在有吸烟史、细胞分化差及有淋巴结转移的患者中有较高表达(P<0.01)；Ki-67蛋白表达的影响因素为细胞分化程度和淋巴结转移情况(P
肾细胞癌(renal

cell carcinoma, RCC)起源于肾实质肾小管上皮细胞,其发病率高,大约90%的肾脏恶性肿瘤为RCC。随着人们生活方式和生活环境的改变,肾癌的发病率不断增加。据世界癌症中心资料显示,2015年美国预测新发的肾癌患者人数为61,560,肿瘤特异性死亡患者数目也高达14,080。我国肾癌的患病人数也逐年增加,少于膀胱癌成为泌尿男生殖系第二位肿瘤。对于晚期转移性RCC患者来说,免疫治疗和靶向药物治疗已成为各大指南推荐的治疗策略。尤其随着分子遗传学的发展,越来越多的分子信号通路被发现在RCC中行使着重要的功能。在此基础上,美国、欧洲以及中国批准了越来越多的靶向药物用于治疗晚期转移性RCC。然而,随着分子靶向药物的应用,靶向药物的耐药性问题严重影响了RCC治疗的疗效。因此寻找RCC发生发生进展中新的靶点以及信号通路,预测RCC患者的预后,指导靶向药物的选择以及寻求靶向药物耐药后的解决方案已成为晚期转移性RCC研究中亟待解决的问题。Cullins进化上高度同源,参与构成了最大的E3泛素连接酶,参与调控细胞周期、转录、信号转导和发育等重要的生物进程。人类基因编码8种Cullin成员,包括CUL1、CUL2、CUL3、CUL4A、CUL4B、CUL5、CUL7和PARC。CUL4B在细胞增值、DNA复制及细胞周期调控等方面行使相应功能。X染色体上CUL4B发生突变可以造成精神发育迟滞。敲除CUL4B的小鼠在胚胎阶段发生死亡。除此以外,CUL4B具有定位于细胞核的信号,在细胞核里面行使相关功能。研究证实CUL4B能够抑制miR-372和miR-373,上调CDK2的表达,从而促进DNA的复制。此外,CUL4B能够下调抑癌基因p16、PTEN等的功能,促进肿瘤的发生。因此,最近一段时间许多研究都发现了CUL4B在恶性肿瘤中行使相应的功能。研究发现CUL4B与肝癌、结直肠癌、胶质瘤、骨肉瘤以及肿瘤微环境等密切相关。但是,CUL4B在泌尿系统的肿瘤尤其是RCC中的作用及机制尚未有文献报道。c-Met是酪氨酸激酶受体(receptor 确认细节 tyrosine kinase, RTK),与其特异性配体肝细胞生长因子(hepatocyte

那个 growth factor, HGF)相结合后,发生同源二聚化和磷酸化,从而发挥相应的作用。c-Met与HGF结合后激活一系列通路,包括Ras/Raf/MEK/ERK通路、PI3K/Akt通路以及黏着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)通路等。HGF/MET是调控血管生成、细胞增殖、细胞周期以及细胞侵袭转移等的重要信号通路。尽管c-Met在正常生理条件下对于维持组织稳态非常重要,但是c-Met突变、扩增以及过表达等变化,造成其在人类肿瘤中异常激活。研究发现c-Met在肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma, ccRCC)和乳头状肾细胞癌(papillary renal cell carcinoma, pRCC)中均过表达。c-Met的表达水平与RCC的病理特性以及疾病的预后转归关系密切。因此c-Met抑制剂如卡博替尼等作为RCC治疗中的靶向药物也纷纷进入临床试验阶段。近期研究表明c-Met激活与恶性肿瘤分子靶向药物治疗中的耐药问题关系密切。因此,c-Met在RCC发生发展及靶向药物耐药等方面具有重要研究价值,但是CUL4B对c-Met通路是否有调控作用,目前尚未有文献报道。基于以上研究背景,我展开了下面的研究：首先,探讨CUL4B在RCC中的表达及作用；然后,寻找CUL4B在RCC中的作用机制,通过蛋白芯片发现c-Met可能在CUL4B的调控中发挥重要作用；最后进一步探讨CUL4B调控c-Met通路对RCC的影响。通过本课题的研究以期发现RCC发生进展中新的靶点和分子信号通路,从而更好地预测RCC患者的预后、指导靶向药物的选择以及寻求靶向药物耐药后的解决方案。第一部分CUL4B在肾细胞癌中的表达及作用已知CUL4B在多种肿瘤中发挥重要作用,且表达量都升高,为进一步探讨CUL4B在RCC中是否同样具有促进肿瘤发生进展的作用,本部分利用了人肾细胞癌细胞系、人肾癌组织标本以及裸鼠成瘤动物模型等实验对象,展开相应研究。具体情况如下：1.