05），术后14天AS-IV组的细胞凋亡程度较UUO组减轻（P<0.05），而黄芪甲苷干预显著改善MAPK信号蛋白的激活（均P<0.05），细胞凋亡增多（P<0.05），减少细胞凋亡的发生（P
目的：胡椒碱(Piperine,Pip)是胡椒(Piper

nigrum Linn)和荜茇(Piper longum Linn)等胡椒属植物果实中提取的一种植物碱,是胡椒中发挥药理作用的主要成分。近年的研究表明胡椒碱具有明确的抗炎效应并且对多种胃肠疾病具有疗效,但关于胡椒碱在肠炎方面的研究很少,其抗肠炎作用的机制也还不够清楚。本课题通过利用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)或灭活的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus cells,SAC)分别刺激人结肠癌细胞系(SW480、HT-29和Caco-2细胞),体外模拟人肠道感染细菌发生炎症,检测Pip对LPS或SAC作用下这些细胞表达炎症因子、抗菌肽防御素以及对NF-κB信号通路、MAPKs信号通路活化的影响,初步探讨Pip发挥抗肠炎作用的机制。方法:1.采用改进的MTT法(WST-1)检测Pip对SW480、HT-29、Caco-2细胞增殖的作用;利用流式微球捕获蛋白定量技术(Cytometric 点击此处 beads array,CBA)检测Pip对LPS刺激SW480和HT-29细胞分泌炎症因子IL-8和IL-10的蛋白表达水平的影响,并用RT-q PCR(Reverse Transcription-Quantitative BVD 523 PCR)检测炎症因子m RNA表达水平的变化;免疫印迹法(Western blotting)检测Pip对LPS活化的SW480细胞NF-κB信号通路、ERK、p38 MAPK和JNK信号通路的调节作用;利用CBA和RT-q PCR分别在蛋白质水平以及m RNA水平上分析p38MAPK和JNK信号通路阻断情况,即在SB203580(p38

MAPK信号通路抑制剂)和SP600125(JNK信号通路抑制剂)作用下,对LPS刺激SW480和HT-29细胞表达IL-8的影响。2.利用RT-q PCR检测Pip对LPS和SAC抑制HT-29、Caco-2细胞表达抗菌肽人α防御素HD5(human alpha-defensin-5)和HD6(human alpha-defensin-6),人β防御素HBD-1(human beta-defensin-1)以及胰岛再生源蛋白(regenerating islet-derived protein,Reg)RegⅢγm Y-27632 价格 RNA的调节作用。结果:1.Pip处理可剂量依赖性地抑制SW480、HT-29和Caco-2细胞的增殖,半数抑制浓度IC50分别为147.6μM、328.5μM和155.1μM,表明Pip对这些细胞的毒性较小。CBA和RT-q PCR检测结果显示Pip能从蛋白质水平及m RNA水平上抑制由LPS诱导的SW480和HT-29细胞表达IL-8,且蛋白质水平上的抑制作用呈现剂量依赖关系;而免疫印迹分析表明,Pip可抑制LPS诱导的p38 MAPK和JNK信号通路的活化;CBA和RT-q PCR检测结果显示使用SB203580抑制p38 MAPK信号通路后,由LPS诱导的细胞表达IL-8无论在蛋白质水平及m

RNA水平上均有显著下调。2.RT-q PCR检测显示,HT-29和Caco-2细胞HD5、HD6的m RNA表达水平在LPS或SAC的刺激下均有显著下降,而Pip对LPS或SAC下调HT-29和Caco-2细胞表达抗菌肽防御素具有显著的拮抗作用。结论:1.Pip能抑制LPS刺激的SW480和HT-29细胞分泌炎症因子IL-8从而发挥抗炎作用,其机制很可能与抑制p38 MAPK和JNK信号通路活化有关。2.Pip可能通过拮抗病原体诱导肠上皮细胞表达抗菌肽防御素的抑制作用,进而发挥其抗肠炎作用。
在哺乳动物的体内,含硫氨基酸在胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase,CSE)的催化下可以产生内源性硫化氢(hydrogen sulfide, H2S)。内源性H2S具有广泛的生理调节功能,在炎症性疾病的发生发展过程中同样发挥着重要作用。在内毒素和感染性休克时,血浆H2S含量、体内多个组织内源性H2S的生成以及CSE的表达和活性均显著增加,而CSE表达上调的机制尚不明确,本研究第一部分首先在小鼠腹腔巨噬细胞系RAW264.7细胞证实了内毒素脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)能够显著上调CSE mRNA和蛋白表达,继而研究了LPS诱导CSE表达的信号转导机制。结果发现, PKC、PI3K和NF-κB信号通路参与了LPS诱导CSE表达的过程。糖皮质激素(glucocorticoids, GCs)是临床常用的抗炎抗休克药物,已有大量资料表明GCs可以抑制体内另一种在内毒素和感染性休克中发挥重要作用的内源性气体分子一氧化氮生成以及一氧化氮合成酶的表达,然而GCs对内源性H2S的生成有何调节作用目前尚不清楚,因此本研究第二部分探讨了糖皮质激素(地塞米松,DEX)对RAW264.

了解高糖和AGEs联合刺激对THP-1细胞氧化应激的影响; 很少 3.了解HO-1在高糖和AGEs所致THP-1细胞氧化应激中的表达变化; 4.探讨p38MAPK信号通路是否参与了高糖和AGEs诱导的THP-1细胞HO-1表达。 【方法】 1.细胞培养:采用含10%胎生血清的RPMI1640培养基,于37℃、5%CO_2培养箱内传代培养人单核细胞株THP-1。

2.体外制备AGEs:将牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)与葡萄糖混合于37℃孵育60天,4℃透析24tl以去除未结合的葡萄糖。 3.细胞ROS产量检测:分别用5、15、25mmol/L的GLU或25、50、100μg/mL的AGEs刺激细胞,分别于刺激0.5、2、6、24h后收集细胞,DCFH-DA荧光探针标记,流式细胞仪检测平均荧光强度(mean fluorescence intensity,MFI)。 4.细胞分组:分为4组,即15mmol/LGLU组(高糖组)、100μg/mLAGEs组(AGEs组)、15mmol/LGLU+100μg/mLAGEs组(高糖+AGEs联合组)及对照组。 5.细胞培养液上清TNFa水平检测:采用ELISA方法进行。 6.细胞培养液上清中MDA水平检测:采用硫代巴比妥酸法(thiobarbituric acid,TBA),严格按照试剂盒说明步骤检测。 7.RT-PCR法检测HO-1mRNA表达:提取总核糖核酸(ribonucleic acid,RNA),两步法进行RT-PCR,扩增产物于1.5%琼脂糖凝胶进行电泳。 8.免疫印记(western blot,WB)法检测HO-1蛋白表达:提取总蛋白,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectropheresis,SDS-PAGE),电转移至硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter,NC)封闭非特异位点。利用多克隆兔抗人HO-1抗体及HRP标记的二抗与NC反应,DAB显色后拍照分析条带亮度。 9.SB203580(SB,p38MAPK抑制剂)干预实验:分为高糖组、SB+15mmol/LGLU(SB+高糖)组、AGEs组、SB+100μg/mLAGEs(SB+AGEs)组。10μmo/LSB干预30min后换以含15mmol/LGLU或100μg/mL 那个 AGEs细胞培养液继续孵育24h,收集细胞进行RT-PCR检测HO-1mRNA表达水平。 10.统计学处理:用SPSS13.0软件对所有数据进行统计学处理;实验数据计量资料以均数±标准差((?)±s)表示。多组间资料比较用析因设计的方差分析(ANOVA),任意两组间比较采用独立样本的t检验,相关分析采用积矩相关系数(Pearson相关系数)分析,检验标准为α=0.05。 【结果】 1.制备的AGEs浓度:AGEs的荧光浓度为101.29U/mg,对照BSA的荧光浓度为13.68 U/mg,前者为后者的7.40倍。

2.GLU和AGEs刺激THP-1细胞的ROS产量:均表现为0.5h的ROS产量急剧升高,随着时间延长轻度下降,但于24h再度上升至较高水平,在6h、24h时间点的ROS产量表现为GLU和AGEs浓度依赖性升高。高糖组(65.88±1.61)和AGEs组(67.46±3.78)的ROS产量均显著高于对照组(41.95±1.36)(P＜0.001),高糖+AGEs联合组(107.21±8.94)显著高于GLU组和AGEs组(P＜0.01),且高糖和AGEs对ROS产量的影响具有协同作用(P＜0.05)。 3.细胞培养液上清的MDA水平(nmol/mL):高糖组(1.59±0.53)显著高于对照组(0.65±0.23)(P＜0.05),AGEs组(1.56±0.97)虽然也高于对照组,但统计学差异不明显(P＞0.05),高糖+AGEs联合组(3.26±0.32)显著高于GLU组和AGEs组(P＜0.05)。 4.细胞培养液上清的TNFa水平(pg/mL):高糖组(25.38±1.95)和AGEs组(24.43±2.65)显著高于对照组(14.97±1.49)(P＜0.01),高糖+AGEs联合组(51.25±1.72)显著高于高糖组及AGEs组(P＜0.001),高糖和AGEs对TNFa的影响存在协同作用(P＜0.001)。 5.细胞HO-1mRNA的表达:高糖组(0.42±0.02)和AGEs组(0.48±0.03)显著高于对照组(0.15±0.01)(P＜0.001),高糖+AGEs联合组(0.89±0.12)显著高于高糖组及AGEs组(P＜0.05)。 6.THP-1细胞的HO-1蛋白表达:高糖组(0.39±0.01)和AGEs组(0.45±0.03)显著高于对照组(0.15±0.01)(P＜0.05),高糖+AGEs联合组(0.81±0.02)显著高于高糖组及AGEs组(P＜0.05),高糖和AGEs存在协同作用(P＜0.01)。

7.相关分析:HO-1蛋白表达水平与HO-1mRNA、ROS产量、MDA及TNFα均呈显著正相关(P＜0.001)。HO-1mRNA与ROS、MDA及TNFα均呈显著正相关(P＜0.001)。ROS产量与MDA、TNFα呈显著正相关(P＜0.001)。TNFα与MDA呈显著正相关(P＜0.001)。 点击此处 8.SB203580(SB)(p38MAPK抑制剂)干预实验结果:各组之间HO-1mRNA表达均无显著的统计学差异(P＞0.05)。 【结论】 1.高糖和AGEs单独刺激能导致THP-1细胞氧化损伤加剧、分泌炎症因子TINFα水平及HO-1表达增高,二者联合刺激能使上述改变进一步加剧。 2.p38MAPK抑制剂对高糖和AGEs诱导的THP-1细胞HO-1mRNA表达无显著影响。 3.HO-1表达与细胞氧化损伤及炎症指标呈显著正相关,提示高糖和AGEs导致THP-1细胞氧化损伤及炎症反应,后者诱导HO-1表达适应性和代偿性增高,从而发挥细胞保护作用。 第二章抑制HO-1对高糖和AGEs致THP-1细胞氧化应激的影响 【目的】 探讨抑制HO-1表达对高糖和AGEs刺激下THP-1细胞氧化应激的影响。 【方法】 1.细胞分组:分为4组,即对照组、15mmol/LGLU+100μg/mLAGEs(GLU+AGEs)组、ZnPP组及ZnPP+15mmol/LGLU+100μg/mLAGEs(ZnPP+GLU+AGEs)组,其中对照组和ZnPP组THP-1细胞培养液的GLU浓度均为5mmol/L。 2.细胞ROS产量、细胞培养液上清中MDA及TNFa水平、HO-1mRNA及蛋白表达水平检测同第一章。 3.统计学处理:用SPSS13.0软件对所有数据进行统计学处理。实验数据计量资料以均数±标准差((?)±s)表示。多组间资料比较用析因设计的方差分析(ANOVA),任意两组间比较采用独立样本的t检验,检验标准为α=0.05。 【结果】 1.各组细胞ROS产量(MFI)的比较:ZnPP+GLU+AGEs组(128.

大柴胡汤对慢性胰腺炎小鼠胰腺组织病理学改变的影响 HE染色显示： DBTC尾静脉注射1w可见胰腺明显呈急性炎症的表现；2w胰腺小叶水肿，可见腺泡细胞点片状坏死及炎细胞浸润；随着造模时间的延长，胰腺结构破坏更加明显，至4w可见纤维组织沉积，8w时胰腺纤维化明显，取代了正常的胰腺腺泡细胞及胰岛。经大柴胡汤灌胃治疗后，与同时间点模型组相比，胰腺损伤明显减轻；至8w仅有少量纤维组织沉积。 Alectinib数据表 胶原纤维（Masson）染色显示DBTC尾静脉注射后现少量蓝染的胶原纤维在间质中出现；随着造模时间的延长纤维化明显增加，至8w可见大量胶原纤维广泛增生，胰腺组织被纤维严重分割。大柴胡汤灌胃治疗后各时间点胰腺纤维化的程度明显减轻。

2．大柴胡汤对慢性胰腺炎小鼠血清AMS、HA、胰腺MMP/TIMP及MAPK通路的影响 DBTC尾静脉注射联合饮用乙醇后，血清AMS的活性明显升高；造模后2w、4w，血清AMS维持在较高水平，8w血清AMS水平显著降低，与对照组相比差异有显著性（P<0.01）；大柴胡汤治疗组1w、2w、4w血清AMS活性明显下降,与相应时间点模型组相比有显著性差异(P<0.01)，而8w血清淀粉酶活性没有出现明显下降，与模型组相比有所升高，差异存在显著性（P<0.01）。DBTC尾静脉注射联合饮用乙醇2周、4周后，血清HA明显升高,8周后进一步升高，与对照组相比有显著性差异（P<0.01）；大柴胡汤治疗组血清HA明显降低,与相应时间点模型组比较存在显著性差异(P<0.05)。而胰腺组织TIMP-1mRNA表达在造模2w时明显升高，4w、8w表达有所下降，但仍处于较高水平。大柴胡汤灌胃治疗后，2w、4w胰腺组织TIMP-1mRNA的表达降低，与模型组比较，具有明显差异（P
慢性疼痛是指由组织损伤,包括物理创伤、各类炎症以及自身免疫等原因引起的持续性疼痛,常表现为包括损伤部位及其投射区在内的广泛区域的疼痛、痛觉敏感和感觉异常。疼痛信号被外周感受器感受通过痛觉传导通路最终投射到皮层相关区域产生痛觉。慢性疼痛的发生主要是由于受到反复伤害性刺激使痛觉传导通路上神经元功能改变,包括神经元的异位放电、神经递质的大量释放和突触长时程增强等。然而,大量的证据提示疼痛尤其是慢性疼痛的产生不只是与神经元的活动有关,神经系统的另一类细胞-神经胶质细胞也发挥了重要作用,而神经元的功能改变与神经胶质细胞的活化密切相关。

中枢神经系统主要由神经元和各类胶质细胞组成,且胶质细胞的数量远大于神经元。传统理论认为,胶质细胞主要起支持、保护、营养和免疫等作用。即神经元是神经系统内参与神经功能活动的主体细胞。胶质细胞只对维持神经元的各项活动起支持作用。但是,随着对胶质细胞研究的不断加深,越来越多的资料表明,胶质细胞不仅仅是参与神经系统的生理或病理活动,而是在其中发挥了重要作用。 查找更多 在中枢神经系统中,神经胶质细胞主要包括星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞,其中小胶质细胞被认为是神经系统内的免疫细胞,参与神经系统的修复、免疫活动和炎症反应。近几年的研究发现,小胶质细胞的激活与各类神经、精神疾病,如神经退行性疾病PD、AD和抑郁症等密切相关。此外,研究还发现脊髓小胶质细胞与慢性疼痛的发生密切相关。在痛信号产生的初始阶段,就伴随有小胶质细胞的活化,包括明显的形态结构变化以及各种细胞因子(TNF-α、IL-1β、BDNF)的释放、活性氧自由基的生成等等。这些物质会作用于神经元并影响其功能,其结果是强化痛信号的产生和传递。虽然大量证据表明活化的胶质细胞参与了疼痛信号的传递,但是胶质细胞如何被活化目前并不十分明确。由于神经元与胶质细胞同属一个神经网络,常规的疼痛研究实验体系(围绕神经元设计的实验体系)无法区分痛刺激对神经元及神经胶质细胞的单一效应,大大限制了对胶质细胞活化尤其是活化机制的了解。此外,由于痛信号主要是由各种神经递质传递,因此有必要观察神经递质对脊髓胶质细胞的活化作用及相关机制。

传递伤害性信息进入脊髓的神经递质有ATP、谷氨酸、P物质和CGRP等。已有实验显示,ATP可通过小胶质细胞上的P2X4受体激活小胶质细胞,并且参与慢性疼痛的形成,而其它神经递质对脊髓小胶质细胞的活化及活化机制并不明确。P物质被认为是痛相关甚至是痛特异的神经递质,P物质属于肽类神经递质,介导外周伤害性信号由外周传入脊髓并参与脊髓内痛觉调制,其受体为NK-1受体。脊髓的小胶质细胞也表达有NK1受体,但是P物质对小胶质细胞的作用,如是否会直接刺激活化小胶质细胞,通过何种通路活化,以及其是否参与慢性疼痛目前尚不清楚。 基于目前关于胶质细胞在疼痛过程中发挥作用的实验设计的局限性,我们采用了离体培养的胶质细胞,直接观察相关的生物活性物质如P物质等对胶质细胞的作用并分析其信号通路,同时设计在体实验即将活化的胶质细胞注入脊髓蛛网膜下腔观察其对脊髓水平痛信号产生的影响。希望通过离体和在体的实验观察提供P物质通过活化脊髓小胶质细胞参与疼痛的确切证据。 目的： 1、通过离体培养脊髓小胶质细胞观察P物质对小胶质细胞的活化作用,包括细胞形态学观察和对TNF-α、IL-β释放量的检测。 2、通过P物质作用于离体培养的脊髓小胶质细胞,观察小胶质细胞胞内信号分子的变化。 3、利用痛行为检测的方法观察经P物质刺激活化的小胶质细胞对动物痛行为的影响。方法： 1、取出生24h以内的SD大鼠脊髓原代培养脊髓小胶质细胞。将培养的小胶质细胞分为4组：(1)空白对照组,细胞孵育全培液；(2)P物质200μM组；(3)P物质400μM组；(4)P物质800μM组；各组细胞分别孵育2h、6h、12h、24h后进行后续实验。 Gefitinib溶解度 2、采用免疫细胞化学法鉴定OX-42阳性的小胶质细胞,并观察P物质孵育后小胶质细胞的形态改变。 3、采用ELISA的方法检测P物质孵育后小胶质细胞对TNF-α和IL-p的释放情况。 4、利用激光共聚焦显微镜胞内钙离子成像技术观察P物质孵育后小胶质细胞胞内Ca2+浓度变化。 5、采用免疫荧光双标的方法观察P物质孵育后小胶质细胞胞内p38MAPK的磷酸化水平。 6、将体外P物质预先孵育的原代小胶质细胞鞘内注射至SD大鼠腰膨大部位蛛网膜下腔,测定注射前、注射后6h、12h、24h大鼠的痛行为改变,以缩足反射潜伏期(PWL)为指标,观察P物质活化的小胶质细胞对大鼠痛行为的影响。结果： 1、经OX-42免疫细胞化学方法鉴定,培养细胞为小胶质细胞,DAPI复染,证实细胞纯度达95%以上。 2、以全培液为空白对照,P物质200gM孵育后,细胞形态与空白对照几乎没有差别。P物质400μM组细胞胞体变大变圆,细胞形态保持完整,随观察时间延长,OX-42免疫染色增强。P物质800μM组细胞OX-42免疫染色增强,但多数细胞形态并不完整。 3、TNF-a的检测结果显示,P物质200μM组在4个时间点与空白对照组相比,均无统计学差异。P物质400μM和800μM组从6小时开始,TNF-α释放量明显增加(分别为276.63±15.3和447.57±19.36),12h达到高峰(分别为445.45±30.27和759.38±47.

7-0.9μm范围,中值直径在0.1μm左右,气溶胶总浓度为0.2mg/m3。暴露后小鼠从病理症状看出类似急性呼吸窘迫综合症,并最终导致全身器官衰竭而死亡。经双向电泳及质谱鉴定等技术分析出6种肺组织差异表达蛋白：载脂蛋白A-1、14-3-3蛋白、高迁移率族蛋白B1、过氧化物酶6、二氢嘧啶酶相关蛋白-2、硒结合蛋白-1,分别与脂肪代谢、蛋白质表达调控、机体功能调控、氧化还原、神经元合成、抗癌元素结合等功能相关。为建立生物气溶胶感染模型和肺沉积模型提供了新的实验依据,为蓖麻毒素气溶胶粒子致呼吸系统损伤机制的研究奠定了理论基础,同时有望深入阐明蓖麻毒素的致毒作用机制提供了新的方向,为呼吸系统治疗药物的开发提供新的靶点和契机。
近二十年来,随着分子生物学理论和分子生物技术的迅猛发展,研究者获得了大量与动植物经济性状的遗传标记和候选基因,使得分子育种日益受到重视。在动物生产中,标记辅助选择(marker

assisted selection,MAS)能够直接在DNA水平上对性状进行有选择性地选择,选择准确性得到极大较高。动物生产和遗传育种工作者通过标记辅助选择,结合常规的育种选择,使得猪的生产性状有了较大幅度的提高。 本研究利用比较基因组学、生物信息学和分子生物学等方法,对3个猪骨骼肌生长发育相关的基因:原肌球调节蛋白1(TMOD1)、促分裂原活化蛋白激酶激酶3(MKK3)和促分裂原活化蛋白激酶激酶6(MKK6)的部分基因组序列进行了克隆,在此基础上开展了单核苷酸多态(SNP)搜寻及与猪生产性状的关联分析。研究取得的结果如下: (1)成功获取了猪TMOD1基因的cDNA部分序列,MKK3基因第七内含子部分序列和MKK6基因第四内含子部分序列,并已递交到GenBank。 MEK inhibitor药剂 (2)对上述三个基因进行SNPs的检测,发现TMOD1基因第7外显子存在一个A134G突变,属于同义突变,该突变位点能被MvaI识别;MKK3基因第7内含子存在一个C439T突变,该突变位点能被AvaⅠ识别;MKK6基因第4内含子存在一个A324G突变,第9内含子存在一个C208T突变,分别能够被AvaⅢ和AluI所识别。 DAPT secretase体外 (3)利用PCR-RFLP方法对上述3个基因4个SNPs在我室与通城县畜牧局合作组建的试验猪群中进行分型和关联分析,试验猪群包括通城(38头)、长白(25头)、大白(22头)、长大通(长白猪♂×(大白×通城)♀)(34头)和大长通(大白♂×(长白×通城)♀)(38头)。结果表明TMOD1基因的SNP-A134G与背最长肌pH显著相关(P＜0.05)。MKK3基因SNP-C439T与胴体直长显著相关(P＜0.05)。MKK6基因的SNP-C208T主要与大理石纹显著相关(P＜0.05)。

(4)对上述3个基因4个SNPs在美国依阿华州立大学Berkshire×Yorkshire F2群体中(n=515)中进行分型和关联分析。结果发现TMOD1基因的SNP-A134G与眼肌面积、平均背膘厚、最后肋背膘厚、腰部背膘厚、第10肋背膘厚、腿肌pH和背最长肌pH显著相关(P＜0.05);MKK3基因SNP-C439T与眼肌面积、硬度显著相关(P＜0.05);MKK6基因的SNP-A324G与平均糖酵解能力和系水力显著相关(P＜0.05);MKK6基因的SNP-C208T主要与测试期日增重和初生重著相关(P＜0.05)。 综合本研究结果,TMOD1、MKK3、MKK6基因与猪的部分生产性状显著关联,可作为影响生产性状的潜在候选基因。
目的

研究黄芪多糖（APS）对腹主动脉缩窄致大鼠心肌肥厚的改善作用及其在能量代谢方面的作用机制。 方法 采用腹主动脉缩窄(AAC)法制作心肌肥厚大鼠模型，实验分为假手术组(Sham组)、肥厚模型组（AAC组）和黄芪多糖治疗组（APS200、400、800mg kg-1组）APS治疗组在手术1周后ig给予APS200、400和800mg 获悉更多 kg-1共给药11周。测定大鼠的心脏血流动力学改变，计算心脏指数(HMI)和左心室质量指数（LVMI）； HE和Masson染色观察大鼠左室心肌形态学改变；免疫荧光和Western法测定心肌细胞骨架及微管蛋白含量；采用高效液相色谱法测定心肌组织中ATP，ADP和AMP含量；测定左心室游离脂肪酸（FFA）和乳酸（LAC）的含量；采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）测定心肌心钠素mRNA（ANPmRNA）表达；采用JC-1法测定心肌细胞线粒体膜电位（MMP）的变化。 结果 与Sham组相比AAC大鼠心脏功能下降，心脏重量指数增加(P<0.01)；光镜下观察：心肌细胞变大，排列紊乱；细胞骨架粗糙，无清晰的结构；心钠素（ANP）的mRNA的表达，心肌游离脂肪酸（FFA）和乳酸（LAC）含量显著升高(P<0.01)；ATP，ADP，AMP含量降低(P<0.01)；线粒体膜电位降低(P<0.01)；与其相比APS组大鼠心脏功能改善，心脏重量指数降低（P<0.05或P<0.01）；光镜下观察：心肌细胞肥大程度较AAC组减轻，心肌纤维排列整齐；心肌细胞骨架明显改善；ANP的mRNA的表达降低（P<0.05或P<0.01）；FFA和LAC含量显著降低；心肌ATP，ADP和AMP含量增高；线粒体膜电位增高（P<0.

天然小分子化合物鹅不食草有效成分6-氧-当归酰多梗白菜菊素(6-O-angeloylplenolin,6-OAP)对肺癌细胞的作用,及对表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor, EGFR)印制剂吉非替尼的增效作用。吉非替尼(Gefitinib)是1990年发现的一种表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(Epidermal

growth factor receptor inhibitor, EGFR-TKI),之后的研究发现吉非替尼具有抑制肺癌细胞的生长、转移和血管生成,并且有诱导肿瘤细胞凋亡的作用,适用于治疗以前接受过化学治疗的局部晚期以及转移性非小细胞性肺癌。基于现有的临床研究结果,吉非替尼对于那些适用的病例有很好的治疗效果,然而因为吉非替尼是激酶抑制剂的原因,所以长时间使用极其容易产生抗药性以及副作用,因此在使用吉非替尼的时候经常需要停药很长时间或者和其他药物一起使用。6-氧-当归酰多梗白菜菊素(6-O-angeloylplenolin,6-OAP)是从鹅不食草中提取的一种倍半萜类小分子化合物,研究发现其对多种肿瘤具有抑制作用。实验室的前期研究发现6-OAP靶向SCF复合物诱导细胞周期G2/M期阻滞的分子机理,并且具有适应的药代动力学特征。进一步我们发现6-OAP对多种肺癌细胞系具有抑制作用,并且在小鼠模型上也具有显著的抗癌效果,前期研究发现其对多种肿瘤具有抑制作用,并且可以增加地塞米松对骨髓瘤的敏感性。因此,我们探索了6-OAP与吉非替尼联合使用是否会克服吉非替尼的耐药性。吉非替尼是表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂,抑制其下游信号通路,6-OAP通过作用于SCF复合物也作用众多的细胞通路,通过对比发现6-OAP与吉非替尼的联合用药比两药单独使用有更好抑制细胞增殖的效果,使用软件计算协同指数。因此我们选用肺腺癌细胞系A549细胞作为我们研究的主要对象,发现6-OAP与吉非替尼的联合使用可以明显的抑制晓得侵袭转移的能力,并且有明显的统计学意义,进一步研究发现6-OAP联合吉非替尼可以明显下调p-AKT、p-ERK等蛋白的水平,增强吉非替尼的抗肺癌作用,为吉非替尼耐药的病人提供了新的治疗可能,为中医药联合西药治疗癌症增加了可能。2.西药治疗疾病的优势是作用机制比较清楚,针对的病症也比较清楚,而中医药的优势在于经过数千年的传承,对于治疗疾病有着自己一整套的完整体系,而具体的作用机制不清楚,这阻碍了中医药在全世界范围内的认可。因此筛取中药中的有效成分是刻不容缓,实验室中拥有众多中药提取物,我们使用多种癌症细胞用来筛取中药中可以抗击癌症细胞系的提取物。我们发现多种抗击癌症的活性成分,Evo是我们近期发现的一个新的天然小分子化合物,初步的研究发现Evo能抑制肿瘤细胞的增殖,诱导细胞在G2/M期阻滞,后续的研究正在进行中。
沙门菌是一种革兰氏阴性兼性细胞内的细菌病原体,具有广泛的宿主谱,在全球范围内感染病例中均表现出有较高的发病率和死亡率。沙门菌的致病性主要依赖于其侵袭细胞及在细胞内生存的能力。而这又依赖于其两个毒力岛SPI-1及SPI-2编码的两个III型分泌系统(T3SS)。T3SS具有分泌和转导多种细菌毒力因子进入宿主细胞的功能。Sop Selleck GDC0449 LDN-193189 B是SPI-1重要的分泌毒力因子,具有肌醇磷酸酶活性,在沙门菌侵入过程中可诱导多种磷酸肌醇的去磷酸化作用。Sop

B已经被证明在侵染过程中影响多种细胞通路,包括细胞膜褶皱形成及抑制SCV与溶酶体的融合等。目前,对于Sop B功能的研究主要关注于其在沙门菌侵染及胞内存活过程中的作用。虽然有研究表明Sop B能够影响多种对炎性反应有调控作用的细胞信号通路,但Sop B是否影响炎性反应的报道仍不多见。炎性体是天然免疫系统的重要组成部分。炎性体是一种多蛋白复合体,在感染或应激条件下,促进促炎细胞因子成熟释放。炎性体组成包括:受体,接头蛋白及效应因子caspase-1。PRRs,包括NLR家族及ALR家族等都能启动炎性体的组装。活化的NLR或ALR促进ASC的聚集,而ASC的聚集招募caspase-1进入ASC斑点,启动caspase-1的自溶性活化,从而诱导的IL-1β及IL-18的蛋白水解过程。作为宿主重要的防御机制,炎性体的活化受到多种因素的严格调控,例如:受体的自抑制及修饰作用。病原同样可以利用毒力因子抑制炎性体功能,从而达到免疫逃逸的目的。既然,Sop B蛋白在沙门菌侵染及维持胞内存活都具有重要的作用,其是否影响沙门菌诱导的炎性体活化。因此,本研究利用λRed重组系统对沙门菌SL1344进行Sop NLG919半抑制浓度 B编码基因的敲除,并以低拷贝的p STV28为表达载体分别构建了全长sop B基因回补质粒及sop B突变回补质粒。随后,将回补质粒电转至△Sop B菌株中,由此成功获得三株重组菌株,包括△Sop B::Vect,△Sop B::Sop B及△Sop B::C460S。炎性体活化试验中,为了探究Sop B蛋白是否影响沙门菌诱导的炎性体。应用ELISA方法检测Sop B对沙门菌诱导的IL-1β进行测定,LDH的释放分析细胞死亡,并应用Western

blot分析caspase-1、IL-1β、AKT的活化情况及ASC寡聚化水平。免疫荧光分析ASC斑点形成水平等。结果显示沙门菌毒力因子Sop B通过诱导AKT信号活化显著抑制沙门菌诱导的炎性体活化。
研究背景:乳腺癌是目前中国女性最常见的恶性肿瘤,也是全世界肿瘤致死的首要原因。三阴性乳腺癌是指免疫组织化学染色显示雌激素受体、孕激素受体和人类表皮生长因子受体2均为阴性的一种特殊的乳腺癌。三阴性乳腺癌约占乳腺癌的12-17%,比非三阴性乳腺癌的侵袭性更强、复发转移更早,在转移性乳腺癌中生存率更低,预后更差。此外,由于三阴性乳腺癌对内分泌治无反应,目前治疗主要以手术为主,辅以全身性化疗,但该肿瘤异质性大,临床预后差,寻找有效的分子指标和治疗靶点已迫在眉睫。LETM1蛋白是一种在人类及酵母中都较为保守的线粒体内膜蛋白,它能减少线粒体的生成及ATP的产生。其表达水平的异常能诱发线粒体功能的紊乱,从而导致包括肿瘤等人类多种疾病的发生。在人类众多恶性肿瘤中都发现LETM1蛋白表达水平显著升高,但是LETM1过表达在三阴性乳腺癌中的临床病理特点和预后意义仍不清楚。本研究旨在探讨LETM1蛋白过表达在三阴性乳腺癌中的临床预后评估意义。材料与方法:选取组织标本共214例,其中包括107例三阴性乳腺癌,42例导管内原位癌,65例癌旁正常组织。首先,应用细胞免疫荧光染色检测方法分析LETM1蛋白在MCF-7乳腺癌细胞中的定位情况。然后采用免疫蛋白印迹方法在三阴性乳腺癌组织中对LETM1蛋白进行相对定量,验证LETM1蛋白在三阴性乳腺癌中是否存在过表达。最后,采用免疫组织化学方法检测LETM1蛋白在三阴性乳腺癌、导管内原位癌及正常组织中的表达情况,并分析其蛋白表达在三阴性乳腺癌中的临床病理意义。结果:1.

38±145.24)、血清MDA水平(66.04±13.67 vs 0.77±0.23)明显高于无并发症组(P＜0.05)。 3.各组HO-1表达的比较:正常对照组的外周血单核细胞HO-1mRNA(0.44±0.26)和蛋白(16.37±15.01)表达水平均低于两个糖尿病组(P＜0.01),而并发症组HO-1mRNA(1.02±0.27 vs 0.77±0.23)及其蛋白(85.74±10.89 vs61.45±21.81)表达水平均显著高于无并发症组(P＜0.05)。 4.相关分析显示,HO-1蛋白表达水平与HO-1mRNA(r=0.750,P=0.000)、ROS(r=0.608,P=0.000)、MDA(r=0.623,P=0.000)呈显著正相关。HO-1mRNA与MDA(r=0.449,P=0.010)、FPG(r=0.364,P=0.041)及2hPG(r=0.477,P=0.016)呈显著正相关。MDA与ROS呈显著正相关(r=0.788,P=0.000)。 5.偏相关分析显示,在控制BMI、FPG、2hPG、HbAlc影响因素后,HO-1蛋白表达仍与ROS产量(r=0.567,P=0.027)、MDA(r=0.613,P=0.015)呈显著正相关,MDA与ROS产量呈显著正相关(r=0.911,P=0.000)。 也许 【结论】 1.初诊T2DM患者的血糖、血清MDA、外周血单核细胞ROS产量及HO-1表达均显著高于正常对照组,提示初诊T2DM可能由于机体抗氧化防御机制的代偿性增高仍不足以对抗高血糖引起的氧化损伤,导致机体处于氧化应激状态。 2.并发症组的血糖水平、氧化应激指标及HO-1表达均显著高于无并发症组,提示高血糖及其引起的氧化损伤可能参与了初诊T2DM患者慢性并发症的发病机制,在排除BMI及血糖水平等因素的影响后,氧化应激指标仍与HO-1表达呈显著正相关,提示HO-1作为一种应激反应蛋白,在糖尿病所致氧化应激情况下代偿性表达增高,但仍不足以对抗该氧化应激。提示除严格控制血糖外,通过适当的手段诱导HO-1高表达将是极具潜力的糖尿病慢性并发症防治的新靶点之一。
研究背景

动脉粥样硬化是慢性炎症性疾病。高脂血症时,血浆低密度脂蛋白(LDL)进入动脉壁氧化成为氧化低密度脂蛋白(oxLDL),被巨噬细胞吞噬后转化为泡沫细胞,发生动脉粥样硬化。既往研究证实,天然属性IgM亚类抗体通过封闭oxLDL与巨噬细胞结合的表位,抑制巨噬细胞对oxLDL的吞噬,从而降低泡沫细胞与动脉粥样硬化斑块的形成。临床研究发现血清高浓度脂多糖/LPS与动脉粥样硬化发病密切相关,但机理尚不十分明确。

目前还没有关于高脂饮食饲养的正常小鼠是否能够诱导产生天然属性抗氧化低密度脂蛋白IgM亚类抗体,从而能影响动脉粥样硬化发生发展;体内或者体外应用这些天然抗体是否有保护作用;以及在LPS血清浓度升高提高动脉粥样硬化的发病过程中,这些天然抗体是否参与尚未见报道。基于以上,我们设计并完成了相关实验。 selleck产品 目的: 1.制备并鉴定天然属性的抗LDL及抗oxLDL IgM亚类抗体,为研究LDL和oxLDL及其天然抗体在动脉粥样硬化发生发展中的作用奠定基础。 2.探讨天然属性的抗oxLDL IgM亚类抗体对巨噬细胞与oxLDL结合的影响,了解其在动脉粥样硬化发病机制中的作用。 3.以apoE基因敲除小鼠为研究对象,复制动脉粥样硬化模型,研究天然属性抗oxLDL IgM亚类抗体对apoE基因敲除小鼠血脂、血oxLDL和主动脉粥样硬化斑块形成的影响。 4.探讨脂多糖活化对巨噬细胞与oxLDL结合的影响,了解脂多糖活化对天然IgM亚类抗体在动脉粥样硬化中的保护作用的破坏机理,进一步了解天然抗体在动脉粥样硬化中的作用。 方法: 1.给予饲养在无特殊病原体条件下Babl/c小鼠高胆固醇饮食,4周后取脾细胞直接与SP2/0细胞融合,以纯化的LDL及oxLDL为抗原对阳性杂交瘤细胞生长孔进行间接ELISA筛选。鉴定杂交瘤上清的免疫球蛋白亚类、亚型,进而采用免疫印迹、免疫沉淀法和ELISA法对获得的抗体进行免疫学反应性鉴定。 2.体外培养小鼠巨噬细胞系;纯化IgM抗体3A6并将其与Na125I标记的oxLDL作用形成免疫复合物。通过油红O染色及细胞结合同位素标记oxLDL,以观察3A6对巨噬细胞对oxLDL吞噬的封闭作用。 什么 3. 18只8周龄apoE基因敲除小鼠随机分为对照组(腹腔注射PBS/2ml/周);5G8组:(腹腔注射天然属性抗低密度脂蛋白IgM亚类抗体5G8/10μg/g体重,2ml/周)和3A6组(腹腔注射天然属性抗氧化低密度脂蛋白IgM抗体3A6/10μg/g体重,2ml/周)。高脂饲料饲养16周后行处死,分离血清,测定血清脂质含量及血浆oxLDL含量,小鼠原位灌注固定,石蜡包埋,连续切片,HE染色,对各个切面的动脉粥样斑块面积进行分析。

4. LPS刺激巨噬细胞后,通过油红O染色及细胞结合同位素标记oxLDL,观察IgM抗体3A6在LPS活化巨噬细胞情况下对oxLDL吞噬地影响。分别利用TLR4的中和性单抗, p38MAPK阻抑剂SB203580和NF-κB阻抑剂PDTC作用及Fcα/μ受体进行RNA干扰后,利用实时定量RT-PCR和流式细胞术观察Fcα/μ受体mRNA转录及蛋白表达情况。 结果: 1.杂交瘤细胞分泌的抗LDL及抗oxLDL的天然抗体通过ELISA法被筛选出来,可以与LDL或oxLDL发生高亲和力结合,经过4次克隆化,最终获得2株稳定分泌天然属性抗LDL抗体,命名为5G8和2H7,及1株稳定分泌天然属性抗oxLDL抗体,命名为3A6,3株抗体均属于IgM亚类,无交叉反应,可以满足免疫印迹、免疫沉淀、ELISA等实验要求。 2.天然属性抗oxLDL IgM亚类抗体3A6,在体外试验中能够抑制巨噬细胞与铜氧化的LDL的结合,从而降低泡沫细胞的形成。 3. apoE基因敲除小鼠高脂饲料喂养16周后,三组之间的各项血脂及oxLDL含量无明显差异;HE染色结果显示:三组均出现动脉粥样硬化斑块,但3A6组可显著降低胸主动脉斑块面积和校正面积,与对照组和5G8组比较差异有显著性。 4. 3A6不能抑制脂多糖活化的巨噬细胞对铜氧化的LDL的结合,并且促进铜氧化的LDL介导的泡沫细胞的生成。我们分别利用3A6 F(ab′)2、Fcα/μ受体RNA干扰或者利用不识别oxLDL的IgM抑制了oxLDL-IgM与脂多糖活化的巨噬细胞的结合,意味着Fcα/μ受体对这个过程是起作用的。同时,脂多糖促进Fcα/μ受体的表达有时间和剂量的依赖性,TLR4特异性中和抗体的封闭作用可减少LPS的作用。另外,脂多糖诱导的p38MAPK磷酸化和NF-κB 65的转位促进了Fcα/μ受体表达的上调。当使用p38MAPK阻抑剂SB203580和NF-κB阻抑剂PDTC,可降低了Fcα/μ受体表达的上调。 结论: 1.抗LDL及抗oxLDL IgM亚类单抗的制备为研究天然抗体在体内脂质代谢和相关心脑血管疾病如动脉粥样硬化等发生发展中的作用提供了重要的研究工具。 2.

宫颈癌组织中gsk3β、p-gsk3βser9和p-gsk3βtyr216表达阳性率分别为18.8%、68.8%和12.5%。早期宫颈癌患者中gsk3β和p-gsk3βtyr216表达显著高于中晚期宫颈癌患者(25.5%vs.4.0%,χ2=5.193,p=0.029;76.4%vs.52.0%,χ2=4.749,p=0.039),早期宫颈癌患者中p-gsk3βser9表达显著低于中晚期宫颈癌患者(5.5%vs.28.0%,χ2=7.988,p=0.009)。在宫颈癌组织中随着细胞学分级的降低,p-gsk3βser9阳性率也随之升高(7.4%、7.9%和33.3%,χ2=7.329,p=0.031)。淋巴结转移阳性的宫颈癌患者中gsk3β和p-gsk3βtyr216表达均显著低于淋巴结转移阴性的宫颈癌患者(5.9%vs.28.3%,χ2=6.427,p=0.018;52.9%vs.80.4%,χ2=6.878,p=0.014),p-GSK3βser9在淋巴结转移阳性的宫颈癌患者中表达显著高于淋巴结转移阴性的宫颈癌患者(23.5%vs.4.3%,χ2=6.577,p=0.015)。HPV阳性表达与GSK3β阳性表达呈负相关(相关系数R=-0.392,p=0.001),与p-GSK3βtyr216阳性表达呈正相关(相关系数R=0.275,p=0.026),与p-GSK3βser9阳性表达无相关性。2.HPV

为什么 E7可显著增加宫颈鳞癌C33A细胞S期比例,提示HPV E7可促进宫颈癌细胞DNA的复制,从而导致肿瘤细胞的恶性转化。HPV E6、E7过表达可显著增强C33A细胞侵袭迁移能力及增殖能力,并且HPV 许多 E6、E7两者之间有协同作用。3.HPV E6、E7在较短时间(24h内)可通过GSK3β蛋白磷酸化激活,HPV E6、E7联合对于激活GSK3β蛋白磷酸化具有协同作用。HPV E6、E7通过激活GSK3β蛋白磷酸化发挥对GSK3β下游靶基因CyclinD1、β-catenin基因的调控作用。综上所述,我们初步证实:HPV E6、E7通过激活GSK3β蛋白磷酸化发挥对GSK3β下游靶基因CyclinD1、β-catenin基因的调控作用,从而促进了宫颈癌细胞的侵袭、迁移、增殖能力,导致恶性生物学行为。
目的乳腺癌是严重威胁妇女身心健康的恶性肿瘤之一,其发病率在国内呈逐年上升趋势,虽然近年来针对乳腺癌发病分子水平的研究比较深入,发现了多种因子及信号通路参与了乳腺癌的发生发展,但其发病机制仍然不清楚,针对乳腺癌相关分子的研究,仍是当前研究的重要课题。葡萄糖调节蛋白94(glucose

regulated protein, GRP94),是主要贮存于内质网的分子伴侣,与HSP90有50%的同源性,参与内质网应激反应,同时也是未折叠蛋白反应下游关键分子,研究发现GRP94在结肠癌,胰腺癌,食管癌,乳腺癌等多种肿瘤中高表达,且参与了肿瘤的发生与发展,而其相关机制的研究是当前的热点之一。本课题在细胞水平检测了GRP94在乳腺癌细胞中的表达,同时在乳腺癌MCF7细胞中采用RNAi技术靶向下调GRP94表达,观察沉默GRP94对乳腺癌细胞增殖、凋亡及侵袭迁移的影响并探讨其可能机制,有助于发现GRP94与乳腺癌发生发展之间的关系,为寻找新的乳腺癌治疗靶点、乳腺癌的预防与治疗提供理论依据。Wnt/β-catenin信号通路的众多成员都参与了乳腺癌的发生与发展过程,研究发现Wnt信号在乳腺癌中异常活跃,且协同TGFp信号通路参与调节肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭迁移等重要过程,本研究通过沉默GRP94表达,进一步探讨GRP94与Wnt/β-catenin信号通路之间的联系,进而阐释GRP94在乳腺癌发生发展过程中的重要作用。方法1.

Real-time PCR、Western blot分别在mRNA与蛋白水平检测GRP94在乳腺上皮细胞MCF10A、乳腺癌MCF7、MDA-MB-231、BT474及SK-BR-3细胞株中的表达。2.采用RNAi靶向沉默技术,在乳腺癌MCF7细胞株中沉默GRP94基因表达,观察其对MCF7细胞增殖、凋亡及侵袭迁移的影响,并通过Western PLX3397体外 blot分别检测相关分子的表达。3.Western blot检测Wnt/p-catenin信号通路关键分子及相关靶基因的表达。结果1.GRP94在乳腺癌细胞中表达显著增高,且在MCF7细胞中表达最高(P
丝素蛋白(SF)是一种综合性能优良的天然生物材料,通过电纺技术将SF制备成超细纤维实现对天然细胞外基质(ECM)的超微结构仿生是当前骨组织工程(BTE)研究领域的热点之一。电纺SF纤维结合具有再生特性的干细胞将有利于提高BTE方法修复骨缺损的再生功效,这需要提高支架的成骨诱导分化性能。Purmorphamine(PM)是一种新型的嘌呤衍生类小分子药物,具有优良的骨生成诱导活性。本论文主要目的是基于电纺SF仿生纤维,探讨引入PM后SF基纤维的成骨诱导分化功效。为了检测SF本身是否具有成骨诱导能力,本研究首先采用Na2CO3脱胶法从蚕茧中提取SF以及全骨髓贴壁法从大鼠体内提取骨髓间充质干细胞(BMSCs),并对提取的SF和BMSCs进行分析鉴定,然后配制含不同SF浓度(0.01%、0.05%和0.1%)的培养基并对BMSCs进行培养,体外检测这些SF溶液对BMSCs生长、增殖和成骨分化的影响。结果表明:1)蚕茧提取样品的FTIR光谱图在1653、1530.5和1212.

78%、104.08%、108.97%,亦即在formalin注射后5分钟出现了P-p38的表达峰值,随后恢复正常,但又在formalin注射后1天再次出现P-p38的表达增加之后恢复正常。 购买Quisinostat 在此基础上,我们又分别观察了外周或鞘内给予第一组代谢型谷氨酸受体的拮抗剂CPCCOEt或MPEP之后P-p38的表达情况。在formalin注射前15分钟分别在外周或鞘内给予CPCCOEt(100 nmol)、MPEP(50 nmol)或者HEPES(100mM,pH7.4)作为对照,之后在formalin注射后5分钟和1天,取出动物腰膨大部位进行Western

blot检测。结果发现,在外周或鞘内给予CPCCOEt或MPEP之后,可以抑制formalin注射后5分钟时的P-p38的表达增加。而对于formalin注射后1天的P-p38增加,只有在外周给予CPCCOEt时表现出抑制作用。 本实验结果提示:1.formalin外周注射可以引起脊髓p38MAPK的活化,表现为磷酸化的p38MAPK表达增多,提示p38MAPK可能是介导formalin痛反应的主要信号通路;2.外周应用第一组代谢型谷氨酸受体拮抗剂可以抑制脊髓p38MAPK的磷酸化;3.脊髓应用第一组代谢型谷氨酸受体拮抗剂可以抑制脊髓p38MAPK的磷酸化;4.以上结果提示提示第一组代谢型谷氨酸受体(包括外周和脊髓)通过活化脊髓p38MAPK信号通路在formalin引起的慢性痛中发挥重要作用。据我们掌握的文献,这是首次报道第一组代谢型谷氨酸受体通过脊髓(可能是小胶质细胞)p38MAPK在细胞水平介导其功能反应。 结论:1.formalin外周注射可以引起长时程痛敏(持续时间在10天以上),同时伴有脊髓小胶质细胞的活化;2.外周第一组代谢型谷氨酸受体的激活参与了长时程痛敏的发生和脊髓小胶质细胞的活化;3.脊髓第一组代谢型谷氨酸受体的激活参与了formalin诱导的长时程痛敏的发生和脊髓小胶质细胞的活化;4、外周和脊髓的第一组代谢型谷氨酸受体通过脊髓(可能是小胶质细胞)的p38MAPK通路介导上述作用;5、结合我们以往观察到的第一组代谢型谷氨酸受体在formalin急性痛反应中的作用结果提示,第一组代谢型谷氨酸受体(包括外周和脊髓)在痛信号产生和传递及由此引起的痛反应(包括急性痛反应和慢性持续性痛反应)中发挥重要作用。
β_2肾上腺素受体(β_2-AR)激动剂用于哮喘的对症治疗已有60多年的历史。SPFF[2-(4-amino-3-chloro-5-trifluomethyl-phenyl)-2-tert-butylamino-ethanol 为什么 hydro-chloride]是沈阳药科大学制药工程学院合成开发的新型β_2肾上腺素受体激动剂,前期研究工作已证实它具有强大的支气管扩张作用和相对较高的β_2-AR选择性,同时还具有作用时间较长等特点,目前已处于Ⅱ期临床试验阶段。SPFF的结构中含有一个手性碳原子,因而存在一对对映异构体。由于具有不同立体构象的对映异构体在生物活性、毒性、药物代谢动力学等方面常有很大差异,因此,我们比较研究了SPFF的对映异构体((-)-SPFF和(+)-SPFF)的抗哮喘的作用特点,并初步探讨了它们的作用机制。

首先用离体实验考察了(±)-SPFF及其对映异构体对豚鼠气管平滑肌的扩张作用。结果显示,(±)-SPFF及其对映异构体都能够浓度依赖性的松弛静息张力和被气管致痉剂(组胺和乙酰胆碱)收缩的豚鼠气管条,(-)-SPFF的作用强度强于(±)-SPFF和(+)-SPFF。但是,单一对映体和(±)-SPFF松弛离体豚鼠气管平滑肌的最大效应彼此接近,表明三者的内在活性是相似的。同时我们通过对选择性β_2受体阻断剂ICI-118551拮抗(±)-SPFF、(-)-SPFF和(+)-SPFF作用的分析,还证实了SPFF的单一对映体扩张离体气管平滑肌的作用都是通过B_2受体介导的。离体豚鼠肺支气管灌流实验结果显示了(-)-SPFF在扩张整个气道作用中的显著优势,(-)-SPFF与(+)-SPFF的作用强度差别为23.2倍。此外,(+)-SPFF对(-)-SPFF的影响实验结果显示,(+)-SPFF与豚鼠气管条孵育20分钟对(-)-SPFF松弛静息张力气管条的量效曲线几乎没有影响。

PF-02341066浓度 其次,通过整体动物的不同模型,考察了(±)-SPFF及其对映异构体扩张在体气管平滑肌的作用。结果显示,灌胃给药时,(-)-SPFF(0.0625,0.25 and 1 mg·kg~(-1))对组胺和乙酰胆碱混合喷雾引起豚鼠窒息的保护作用与同剂量(±)-SPFF的作用相似:经十二指肠内给药时,(-)-SPFF对组胺诱导麻醉豚鼠肺溢流量增加的抑制作用分别强于(±)-SPFF和(+)-SPFF1.6倍和6.3倍:在肺机械功能实验中,单一对映体(-)-SPFF和(+)-SPFF与(±)-SPFF对肺顺应性的降低具有同等作用强度的抑制作用,(-)-SPFF抑制肺阻力升高作用强于(+)-SPFF约3.5倍。此外,SPFF、(-)-SPFF和(+)-SPFF(0.01、0.1和1μM)对致敏大鼠肺组织接触过敏原时释放组胺具有相似的抑制作用,在不影响小鼠气道粘液分泌的情况下,(-)-SPFF(0.04、0.10mg.kg~(-1))和(±)-SPFF(0.10、0.25 mg.kg~(-1))明显促进家鸽气道纤毛的转运功能,而(+)-SPFF(0.04、0.10和0.25 mg.kg~(-1))对家鸽气道纤毛的转运没有促进作用。静脉注射和口服(-)-SPFF对小鼠的LD_(50)(95%confidence limits)分别为55.7(51.6～59.8)和468.3(393.0～543.6)mg.kg~(-1),而静脉注射和口服(+)-SPFF对小鼠的LD_(50)分别为36.2(33.4～39.2)和297.5(257.5～343.7)mg.kg~(-1),提示(-)-SPFF的毒性低于(+)-SPFF。 此外,我们从激动剂在细胞外与受体的结合特征及在细胞内产生的效应([Ca~(2+)]_i)两方面初步探讨了(±)-SPFF及其对映异构体的作用机制。分别以豚鼠肺和心房组织作为β_2-AR和β_1-AR的来源,以碘标左旋吲哚洛尔((-)[~(125)Ⅰ]pindolol,IPIN)作为标记性配基的放射配基结合实验结果显示,(-)-SPFF对β_2-AR的亲和力分别高于(±)-SPFF 6倍和(+)-SPFF 164倍,这可能是(-)-SPFF扩张气道作用强度较高的原因之一。(-)-SPFF、(±)-SPFF和(+)-SPFF的选择指数(K_(i(atri))/K_(i(lung))分别为24.72、7.43和2.

5mol/L、15mol/L、30mmon/L葡萄糖,另一组细胞分别加入终浓度为1nmol/L、10nmol/L、50nmol/L、100nmol/L浓度的胰岛素,干预24h后,收集细胞。采用实时荧光定量PCR(Real-time Palbociclib细胞系 PCR)和Western Blot方法检测DCs清道夫受体SR-A、CD36、LOX-1的表达。同时,用不同浓度葡萄糖和胰岛素干预DCs24小时后,加入或不加入SR-A、CD36.

LOX-1阻断抗体,将DCs与Dil标记的oxLDL共同孵育3小时,采用激光共聚集方法观测DCs吞噬oxLDL’情况,并用流式细胞术进行定量分析。 结果：与5.5mol/L葡萄糖组相比,在mRNA和蛋白水平,15mol/L、30mmon/L均可明显上调DCs表面清道夫受体SR-A、CD36、LOX-1的表达(p
研究背景再生障碍性贫血(再障,Aplastic Anemia, AA)发病机理较为复杂,近来逐渐认识到免疫机制紊乱包括T淋巴细胞活化,调节性T细胞抑制在再障发中的作用,目前其已成为再障基础研究方面一个最活跃的领域。而调节性T细胞对再障发病机制的研究尚鲜有报道。 红髓脂肪化是再障特征性病理改变。对于再障骨髓中的骨髓组织减少、脂肪组织增多的原因及作用今年来逐渐成为研究热点之一。由于成骨细胞和脂肪细胞共同来源于骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMMSCs), BMMSCs作为骨髓基质细胞的起源细胞,BMMSCs及其分化成的细胞在再障发病过程中的作用逐渐引起人们的重视。 目前国内外均认为骨髓间充质干细胞成骨分化与成脂分化不是彼此孤立的过程,而是存在着相互制约的平衡关系。目前该领域已成为干细胞生物学研究的热点。大量的研究证实这两种分化机制与多种生长因子、及胞内外信号通路紧密相关。成脂分化的诱导因素常常是成骨分化的抑制因素,反之亦然。如过氧化物酶体增殖物激活受体-γ

selleck激酶抑制剂 (Peroxisome proliferation-activated receptor-gamma, PPAR-γ)是成脂分化的主要的诱导因子,同时它可以抑制细胞的成骨分化。 成脂分化与成骨分化是多种信号通路间相互作用的结果,包括BMP、Wnt、 Hedgehogs, Delta/jagged蛋白、FGF、IGF、以及转录因子PPAR-γ(?)Runx2等多条信号通路。目前认为在非Wnt途径中,骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)途径具有重要地位。BMPs是研究最早和最有潜力的诱导间充质干细胞成骨分化的细胞因子,其属于转化生长因子β (transform 这个 growth factor-β, TGF-β)超家族的成员之一,BMP-2是目前研究的较多且作用明显的成骨因子。近来越来越多的研究发现,BMPs可通过MAPKs,PI3K等通路进行信号转导,这些信号转导通路不直接依赖转录因子Smad的激活,其中BMPs-MAPKs通路是通路中重要的一环。

Leptin和Adiponectin是脂肪组织参与免疫调节反应的两个主要的脂肪因子。Leptin对T淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞都具有免疫调节作用。免疫细胞受到免疫刺激后,产生细胞因子(尤其是TNF-a)作用于脂肪细胞,使其分泌Leptin,从而达到使免疫信号扩大化的目的。Adiponectin是脂肪细胞表达最丰的激素。主要在天然免疫效应中发挥作用,能抑制髓单核细胞祖细胞的增殖,抑制巨噬细胞的活性。 那么调节性T细胞是否可以诱导BMMSCs定向分化,分化方向,可能机制及作用。我们对此进行以下研究,以期从一个新的角度探索再生障碍性贫血的发病机制。 目的(1)体外分离、培养、鉴定小鼠BMMSCs,并研究其生物学特点。(2)体外分离、纯化、鉴定小鼠调节性T细胞。(3)调节性T细胞对骨髓间充质干细胞成骨成脂分化的影响及可能机制。(4)建立免疫相关骨髓衰竭小鼠模型,输注调节性T细胞、BMMSCs,观察其对骨髓脂肪化的影响。 方法(1)贴壁筛选法分离纯化BALB/c小鼠BMMSCs,胰酶消化传代,FCM鉴定细胞表型,并在特定诱导剂下诱导向脂肪细胞、成骨细胞及软骨细胞分化。(2)磁珠分选法分离纯化BALB/c小鼠脾脏调节性T细胞,用流式细胞仪鉴定其免疫表型。(3)将磁珠分选法分离纯化的BALB/c小鼠脾脏调节性T细胞与BALB/c小鼠BMMSCs共培养72小时,Real-time PCR, Western Blot检测BMMSCs成骨分化和脂肪分化相关基因和蛋白表达的变化；共培养7天后PNPP法测定碱性磷酸酶活性并进行碱性磷酸酶染色,EL1SA法和免疫组织化学染色进行I型胶原检测；共培养14天进行油红O染色检测脂滴的形成及Von Kossa染色观察钙化结节的形成。(4)应用SiRNA技术沉默BMP-2基因,p38MAPK抑制剂SB203580和ERK1/2抑制剂PD98059, PKA抑制剂H-89, Real-time PCR, Western Blot, Elisa.免疫组化方法检测BMMSCs成骨分化和脂肪分化相关基因和蛋白表达的变化,研究BMP-2, MAPKs, cAMP-PKA通路对调节性T细胞对BMMSCs成骨作用影响。(5)C57BL/6小鼠(父本)和BALB/c小鼠(母本)杂交产生CByB6F1小鼠,将F1小鼠γ射线亚致死量照射(4.

05）；DC组大鼠GSK3α和GSK3β的蛋白表达显著升高（p<0.05）；DCE组GSK3α和GSK3β的蛋白表达与DC组相比显著下降（p<0.05）；P-GSK3α与P-GSK3β显著升高（p<0.05）；DC组大鼠肝脏中AKT2与P-AKT2蛋白表达较CON组均呈下降趋势（p<0.05），而长期耐力运动干预后，DCE组大鼠的AKT2与P-AKT2蛋白表达升高（p
阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)是一种脑部原发性神经退行性病变,主要病理特征包括三方面:老年斑形成、神经元的变性或丢失以及神经纤维缠结。EGCG是茶多酚的主要成分,在机体中有广泛的生物活性,利于预防与氧化应激有关的疾病,比如阿尔茨海默病、帕金森症等。随着全球老龄化的来临及社会竞争压力的增大,AD的发病率日益增加,并已影响到患者及家人的生活质量,因此开发AD的治疗药物迫在眉睫。 [目的]观察EGCG对于SAMP8小鼠的海马神经元在衰老过程中的保护作用。[方法]提取一天新生SAMP8、SAMR1小鼠海马原代神经元。将海马神经元接种于直径为35mm培养皿中,培养液为含20%胎牛血清的DMEM,24h后更换培养液为Neurobasal+2%B27,培养72h后再次换液,细胞培养到第4天时加入不同浓度的EGCG,共培养13天。1.用MTT方法测定适宜的EGCG浓度;2.应用免疫组化的方法观察EGCG对神经元的保护作用;3.用蛋白质杂交的方法检测tau蛋白磷酸化途径中的cdk5、pTauS~(199)、ptauS~(396)、pGsk3βS9的表达。[结果]1.MTT实验表明:用不同浓度的EGCG处理SAMP8小鼠海马神经元后发现:浓度>20μg/mL的EGCG会抑制神经元的生长并导致其死亡,而浓度为
大量研究表明,原癌基因RET和Hedgehog

Decitabine供应商 (Hh)信号通路的异常表达均与发育和肿瘤的发生发展密切相关,但RET是否调控Hh通路却鲜有报道。基于以上疑问,本研究首先借助Hh靶基因Gli-1的双荧光素酶报告基因系统,发现内源表达RET的成神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y经RET蛋白激活物胶质细胞源性神经营养因子(Glial

获悉更多 cell-line derived neurotrophic factor, GDNF)处理,Gli-1报告基因的活性增加。进一步在293T细胞和SH-SY5Y细胞中共转RET过表达质粒和Gli-1报告基因质粒,发现在这两种细胞系中过表达RET均可增加Gli-1报告基因活性,证实RET参与调控Hh通路。过表达RET下游分子Akt的激活形式可增加Gli-1报告基因活性。而使用MK-2206抑制Akt活性或慢病毒敲降Akt后,激活RET并不能上调Gli-1的mRNA水平,证实RET通过Akt调控Hh通路。进一步,为研究Hh通路中的哪个分子是RET调控的靶点,我们利用Cyclopamine特异性抑制该通路的关键分子Smoothened (SMO)的活性,发现激活RET依然能增加Gli-1的mRNA水平,提示RET可能作用于膜受体SMO的下游。通过对SMO下游相关分子PKA、GSK3β、CK1的磷酸化水平检测,发现激活RET或Akt能降低GSK3β的磷酸化。因GSK3β负向调控Hh通路,抑制GSK3β则可激活Hh通路,且该作用不受MK-2206或RET敲降影响,提示RET/Akt可通过抑制GSK3P活性来激活Hh通路。最后,细胞增殖试验表明,RETshRNA.MK-2206以及Cyclopamine处理SH-SY5Y细胞,都能抑制该肿瘤细胞的增殖能力。综上所述,本研究初步证明RET可通过激活Akt,进而抑制GSK3β的磷酸化,最终激活Hh通路来影响肿瘤细胞的增殖水平。
目的:通过研究糖基化终末产物(AGEs)对培养的人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)的生长状态、β淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)的表达及淀粉样前体蛋白(APP)mRNA、糖基化终末产物受体(RAGE)mRNA表达的影响,在细胞水平探讨AGES在阿茨海默病(Alzheimer’s

无 disease,AD)发病中的作用及其可能的机制;并用α硫辛酸(α-lopoic acid,α-LA)对细胞进行干预,在体外观察α-LA对神经细胞是否有保护作用,为其开发利用提供理论基础。 方法:体外人工孵育AGE-BSA,以培养的SH-SY5Y细胞为模型,将细胞随机分成五组,第一组分别加入不同蛋白浓度的BSA(0、20、40、80、160、320ug/ml)处理48小时;第二组分别加入不同蛋白浓度的AGE-BSA(0、20、40、80、160、320ug/ml)处理48小时;第三组不同浓度(0.01、0.1、1g/l)α-LA提前半小时干预细胞,然后加入蛋白浓度为160ug/ml的AGE-BSA处理48小时;第四组0.