结果:成功构建了pGPHI-GFP-Neo-Apollon载体并在K562细胞内稳定表达的细胞克隆,经G418筛选后,重组载体能有效沉默Apollon的表达,Apollon mRNA及蛋白表达水平明显下降。MTT结果显示,基因干扰组细胞对VCR、VP16的敏感性明显增强,其半数抑制浓度(half-inhibitory,IC50)值分别R428溶解度为(0.144±0.018)mg/L、(17.336±3.571)mg/L,明显低于细胞对照组(P<0.05)。流式细胞术检测结果表明,基因干扰组细胞联合化疗药物后细胞凋亡率显著升高(P0.05)。结论:pGPHI-GFP-Neo-Apollon载体能显著增强VCR和VP16对白血病K562细胞的诱导凋亡作用所以,提高K562细胞对化疗药物的敏感性,提示RNA干扰Apollon基因表达能一定程度逆转白血病细胞的多药耐药。
目的:探讨RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术沉默凋亡抑制蛋白Apollon基因表达联合中药川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)能否增强人髓系白血病K5哪里62细胞对长春新碱(vincristine,VCR)和柔红霉素(daunorubicin,DNR)的药物敏感性。方法:依据前期实验筛选出的干扰效果最佳的靶向Apollon的小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)片段,构建pGPHI-GFP-Neo-Apollon真核表达载体,应用LipofectAMINETM2000转染白血病K562细胞,G418稳定筛选。

骨水泥固相/液相比例为1.5:1。各组骨水泥固化后，在扫描电子显微镜上观察材料的表面形态，确定材料各组份的分布情况。 2.将骨水泥样本浸泡于PBS磷酸缓冲溶液中降解4周，检测各组骨水泥降解前与降解后1周、2周和4周的压缩强度和弹性模量。模拟体液中浸泡BC40组骨水泥样本21天后，进行扫描电镜、能谱分析和X射线衍分析，评价材料的体外生物活性。 3.以PMMA组为对照，采用购买JQ1MC3T3-E1小鼠成骨细胞评价新型椎体成型材料的细胞毒性，分析材料对成骨细胞的贴附、增殖和分化的影响。 4.将骨水泥材料植入兔股骨髁部骨缺损模型中12周，采用显微CT和组织学的方法，分析新型椎体成型材料的体内成骨和降解情况。 结果： 1.骨水泥材料固化后的扫描电镜结果提示：BC40和BC50组中壳聚糖颗粒和生物玻璃颗粒均匀的分布于PMMA基质这个当中，而PMMA组呈现光滑的表面结构。 2. BC40组、BC50组和PMMA组的固化时间分别为12.7±0.3min、14.2±0.3min和8.6±0.3min，BC40组和BC50组的固化时间长于PMMA组。BC40组和BC50组的压缩强度经过4周的降解分别降低到72.71±3.53Mpa和63.60±4.92Mpa，而PMMA组的压缩强并且度没有出现明显下降；BC40组和BC50组的弹性模量降低到1.54±0.04Gpa和1.49±0.05Gpa，低于PMMA组的弹性模量。经过PBS中4周的降解，BC40表面形成直径约100μm的不规则大孔。扫描电镜结果示BC40在模拟体液浸泡7天后表面发生了明显的变化，表面有磷灰石结晶形成。能谱分析结果示浸泡7天后材料表面硅元素基本消失，钙元素和磷元素的含量明显增加。浸泡21天后X线衍射分析结果发现衍射角32°位置有高峰形成。

结论：细胞膜去极化导致的细胞膜磷脂酰肌醇合成代谢增加、KCNQ2/Q3功能增强的机制可能与高渗细胞外液影响细胞功能的机制类似。 第四部分PLC在细胞膜电位调节PIP2代谢过程中作用 目的：研究PLC在细胞膜去极化增大KCNQ2/Q3电流过程中的作用，并探索PLC所发挥作用的分子机制。 方法：体外转录的方法制备KCNQ2和KCNQ3通道的cRNA；使用双电极电压和钳记录表达在卵母细胞上的KCNQ2/Q3电流，并观察不同实验条件下电流的变化；薄层色谱的方法检测不同实验条件下卵膜细胞PIP2含量的变化；RNA干扰技术抑制卵母细胞中PLCγ1或PLCβ3的表达；western blot方法检测不同PLC亚型在卵母细胞上的分布情况以及AKt磷酸化情况；免疫共沉淀的方法验证PLCγ1酪氨酸磷酸化情况以及寻找更多PLCβ3和Gβ相互作用情况；免疫磷脂沉淀的方法观察PIP3与PLCγ1相结合情况的变化。 结果：(1) PLC抑制剂U73122对卵母细胞上的KCNQ2/Q3电流自身没有影响，但是对细胞膜去极化增大KCNQ2/Q3电流有阻断作用，也能阻断PMA增大电流的作用，另一PLC阻断剂Edelfosine对去极化增大电流也有阻断作用，但是其自AG-014699分子量身对KCNQ2/Q3有很强的增大作用；(2)薄层色谱结果显示U73122能抑制ND96-K升高细胞PIP_2的作用；(3)卵母细胞膜上主要分布的是PLCγ1亚型，免疫共沉淀结果表明去极化的卵母细胞PLCγ1的磷酸化水平明显增高；(4) RNA干扰实验结果表明PLCγ1表达受抑制后，细胞膜去极化增大电流的作用也受到部分的抑制；(5)免疫印迹结果表明细胞膜去极化使Akt磷酸化水平升高，PIP_3与PLCγ1的结合增多。

2)TAK165协同ATRA诱导AML细胞分化。TAK165与ATRA联合作用于HL60和NB4细胞,通过血细胞计数板计数法,计数并描绘细胞生长曲线,结果表明TAK165可以明显促进ATRA引起的HL60和NB4细胞的增殖抑制作用。通过PI染色法检测细胞周期分布变化,TAK165可以协同ATRA使HL60和NB4细胞周期阻滞于G0/G1期。我们从分子标志、生化功能、形态学和细胞分无化相关基因和蛋白的表达情况几方面确证了TAK165可以增强ATRA引起HL60和NB4细胞分化的作用。ATRA单独作用于HL60和NB4细胞72小时,CD11b阳性率分别为24.8%±3.0%,而TAK165与ATRA联合应用时,CD11b阳性率达到80.0±3.4%。TAK165与ATRA联合作用时,NBT还原能力也较TAK165和ATRA单独作用时明此网站显增强,NBT阳性细胞比例由21.30%±2.45%到93.40%±1.19%。瑞氏-吉姆萨染色结果显示,TAK165与ATRA作用于HL60和NB4细胞,引起细胞胞体变小,细胞核固缩,核质比例下降,而且TAK165与ATRA合用引起的细胞形态学变化与单用组相比更为明显。此外,通过Realtime-PCR和Western blot检测细胞分化相关基因(CIpatasertibEBPB、CEBPE、PU.1),分化相关蛋白(C/EBPp、PU.1)的表达情况,发现TAK165与ATRA联合作用使分化相关基因上调,相关蛋白的表达增加,确证了TAK165可以协同ATRA诱导AML细胞分化。3)TAK165协同ATRA诱导AML细胞分化的机制研究。通过Western blot检测HL60和NB4细胞中HER2蛋白表达,结果显示与HER2高表达的乳腺癌BT474相比,在AML细胞中几乎检测不到HER2蛋白的表达。

我们现药株相对于感株，体内体对曲妥珠单抗应均下降，且流式和蛋白印迹均证实EGFR、ErbB2、ErbB3表达减。然，Src和ErbB3的磷酸化升高以及AKT和MAPK下游信号通路的持续激活许NCI-N87R获得性药的。体长抑实验证实了曲妥珠单抗和塞卡替尼合用戒单独用药对曲妥珠单抗感和药胞株的抑作用，使用周-特指数法证实了曲妥珠单抗和塞卡替尼合AZD2281细胞系用的协同抑作用。在感株不药株的鼠肿瘤模型体内实验：两药合用比单用抑瘤作用著。体信号通路实验：曲妥珠单抗单独使用在NCI-N87胞引起ErbB3和AKT磷酸化的降低，NCI-N87R则无此现象；单独使用塞卡替尼在感及药胞均可降低SRC、EGFR、ErbB2、ErbB3、AKT和MAPK的磷酸化；曲妥珠单抗和塞卡替尼合用3-deazaneplanocin A在感株不药株可以著抑ErbB2的下游信号传导，特ErbB3和AKT的磷酸化。此结果通过疫化鼠肿瘤Akt的磷酸化著降低得证实。 本课题证实了曲妥珠单抗和塞卡替尼的合用比单独用药有幵证明了合用在体内体对胃癌的协同抑作用，初步了服胃癌胞曲妥珠单抗药的，提示曲妥珠单抗和塞卡替尼联合应用在临床治疗胃癌应该新的有的治疗策略。
MK-1775目的：研究疏肝益肾方对三苯氧胺耐药的乳腺癌细胞MCF-7LCC9的逆转耐药作用，并明确其发挥作用的机制. 方法： 1.雌性大鼠去势手术后,分别用疏肝益肾方水煎剂(高、中、低剂量组)、三苯氧胺(TAM组)溶液、生理盐水(空白组)灌胃制备大鼠含药血清. 2.MTT法观察高、中、低剂量疏肝益肾方组、TAM组、空白组的含药血清对野生型MCF-7WT细胞和耐药型乳腺癌MCF-7LCC9细胞体外增殖的抑制作用。

在人上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面均有高表达。研究表明,egfr在前列腺癌细胞中高表达,与pc的增殖、gleason评分、crpc转化均密切相关。以往的研究发现,igf1r和egfr在前列腺癌中有病理性的高表达,都可以通过pi3k/akt信号通路激活dna的损伤修复,与肿瘤的放疗抵抗密切相关。然而单一抑制igf1r或egfr对前列腺癌的也许治疗效果欠佳。虽然我们发现抑制igf1r可以通过抑制前列腺癌细胞的dna修复而对放疗增敏,抑制egfr也有类似效果,但是长时间单一抑制igf1r,可以负反馈激活egfr;长时间的单一抑制egfr,也负反馈激活igf1r。我们也发现,如果联合阻断igf1r和egfr,可以完全阻断pi3k/akt信号通路,而此通路已被证实与前列腺癌细时间胞的dna损伤修复密切相关。研究目的:研究联合抑制igf1r和egfr对前列腺癌放射治疗的增敏效应,并研究其分子机理。为在放疗前联合应用igf1r和egfr抑制剂进行新辅助生物治疗奠定理论基础,为高特异性放疗增敏提供潜在的分子靶点和标记物。研究方法:体外培养人前列腺癌细胞du145、pc3和arcape和arcapm,观察单独或同通常时阻断egfr和igf1r后上述细胞的放疗敏感性;体外培养克隆形成实验检测放射线联合或不联合egfr和igf1r抑制剂对人前列腺癌细胞的作用;流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期的变化;westem-blots检测akt、pakt的表达;免疫荧光实验检测γh2ax和rad51在细胞核内的焦点形成,证明联合抑制增强放射敏感性的机理;建立裸鼠移植瘤模型,在体观察联合抑制对放射治疗的敏感性,并检测前列腺癌细胞的增殖指数。