21和194.67±8.08。II组8 min缺血打击后,从4d开始海马CA1区出现明显的DND,7d时HG为Ⅱ~Ⅲ级、ND为17.33±11.37。与sham组相比,HG明显升高(P<0.01),ND显著降低(P<0.01)。CIP+II组各时间点海马CA1区无明显DND,7d时HG为0～Ⅰ级,ND为190.67±4.16。与II组相比,HG明显降低(P<0.01),ND显著升高(P<0.05),而平均光密度没有明显变化。30min时免疫阳性细胞表达开始增多基本和即刻取材时间点持平,胞核着色也开始加深至3h、1d、2d时神经元着色明显加深(p<0.05)。II组的总面积与sham组比较无明显差异。CIP+II组的阳性标记物总面积比II组明显增高(p<0.05),胞核深染,平均光密度也明显升高(p<0.05),但阳性标记物的总面积和即刻取材时间点比较明显降低(p<0.05)。4d、7d时免疫阳性细胞表达明显减少,细胞轮廓不清,胞核着色明显变浅,与即刻取材时间点比较,免疫阳性细胞的总染色面积和平均光密度均明显降低(p
目的: 1.了解在H_2O_2氧化应激的HaCaT细胞模型中,p38于细胞凋亡中的作用以及褪黑素抗氧化和抑制凋亡的效果。
SB431542 2.探讨大面积深Ⅱ度烫伤大鼠早期应用褪黑素对烫伤皮肤残留毛囊细胞的保护作用。 3.研究大面积深Ⅱ度烫伤大鼠早期应用褪黑素对机体的抗氧化和抗炎作用。 方法: 1.HaCaT细胞分成4组,对照组、氧化组、抑制剂组、褪黑素组。除对照组外,其余3组均给予终浓度为730μmol的H_2O_2刺激12 h。抑制剂组在刺激前用p38抑制剂SB203580与细胞共培养1h;褪黑素组在刺激前用褪黑素与细胞共培养12 h。 2.(1)在刺激后12 h,检测细胞悬液MDA,GSH含量;(2)MTT法检测细胞活力;AO/EB(吖啶橙/溴化乙啶)和Hoechst33258荧光染色,caspase-3活性检测,流式细胞分析仪检测细胞凋亡情况。(3)首先用Western blot检测730μmol/L的H_2O_2刺激HaCaT细胞0(加入H_2O_2后即刻)、5、20、30、60、90min时p38蛋白含量,筛选出p38蛋白表达最强的时间点;然后在此时间点检测各组细胞p38蛋白含量。
3.雄性SD大鼠48只,分为假烫组、烫伤组、褪黑素组,每组16只大鼠。烫伤组和褪黑素组大鼠在背部造成30%TBSA深Ⅱ度烫伤创面,烫伤组和褪黑素组于伤后1 h补充平衡液抗休克治疗。并且褪黑素组于伤后1 min、8 h、16 h,以10 mg/kg的剂量给予腹腔注射褪黑素溶液。 4.每组其中6只于6、12、24 h采集烫伤区域皮肤检测丙二醛(MDA)和还原型谷胱甘肽(GSH);利用原位缺口末端标记法(TUNEL)和半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)免疫组织化学方法检测烫伤皮肤组织残留毛囊细胞凋亡情况。 5.每组其余10只大鼠于12 h采集血清标本检测MDA、GSH等反应自由基水平的指标;用ELISA方法检测TNF-和IL-1β等炎症因子指标。于伤后12 许多 h采集烫伤皮肤组织,用TUNEL和caspase-3免疫组织化学检测残留毛囊细胞的凋亡情况。
结果: 1.(1)在刺激12 h后,氧化组的氧化损伤明显强于对照组;而褪黑素组氧化损伤轻于氧化组,但高于对照组。(2)在刺激12 h后,MTT法显示对照组、氧化组、抑制剂组和褪黑素组细胞生存率分别为(99.12±2.34)%、(80.56±4.65)%、(90.02±5.15)%、(89.10±4.22)%;AO/EB和Hoechst33258荧光染色方法均显示氧化组的细胞凋亡率明显高于抑制剂组和褪黑素组。流式细胞仪检测结果显示对照组、氧化组、抑制剂组和褪黑素组细胞凋亡比例分别为(4.20±1.25)%、(30.01±8.94)%、(15. Bcl-2 inhibitor clinical trial 56±3. 80)%、(12.66±4.22)%。(3)730μmol/L的H_2O_2刺激细胞5 min,p-p38表达开始增加,在30 min后达高峰,90 min时仍明显高于对照组。选择30 min作为刺激时间点,利用Western blot方法发现抑制剂组和褪黑素组的p-p38水平明显低于氧化组。 2.与假烫组比较,烫伤组各时间点的皮肤组织MDA显著升高,伤后12 h达2.83±0.43 nmol/mgprot高峰;GSH水平明显下降,伤后12 h水平最低为0.95±0.21 mg/gprot(P < 0.01)。在所有时间点,烫伤组细胞凋亡率都高于假烫组(P < 0.01)。TUNEL显示烫伤组伤后6 h残留毛囊凋亡细胞率增加到(20.2±3.4)%,在12 h细胞凋亡率最高达到(31.2±3.6)%。与烫伤组比较,褪黑素组MDA水平低于烫伤组,GSH水平高于烫伤组(P < 0.05);褪黑素组的残留毛囊细胞凋亡率低于烫伤组,褪黑素组在伤后6 h、12 h的细胞凋亡率分别(10.9±3.2)%、(19.1±3.7)%(P < 0.05)。caspase-3免疫组织化学显示了相似的凋亡趋势。 3.与假烫组比较,烫伤组伤后12 h血清MDA显著升高,GSH明显下降;TNF- ,IL-1β含量显著增加(P < 0.01)。与烫伤组比较,褪黑素组12 h血清MDA含量降低了34%;GSH增加了37%;TNF-下降了29%;IL-1β降低了35%(P < 0.05)。TUNEL显示烫伤组伤后12 h残留毛囊凋亡细胞率为(30.9±2.5)%,高于假烫组的(3.8±1.9)% (P < 0.01)。而褪黑素组毛囊凋亡细胞率降低为(20.2±2.