4163±0.0503，E_2组吸光值为0.6940±0.0143，与对照组相比有显著意义（P0.05）。（4）流式细胞仪检测细胞周期：E_2组S期所占比例为（33.15±0.212）%与对照组（11.55±0.212）%相比有统计学意义（P<0.05），表明E_2可以刺激EPCs增殖；PD98,059组S期比例（16.25±6.434）%与E_2组相比有统计学意义（P<0.05），表明其可以阻断E_2引起的EPCs增殖；SP600125组S期比例（12.55±1.202）%与E_2组相比有统计学意义（P0.05），表明其不能减弱E_2生物学效应。另外E_2组G1期细胞比例为（34.45±0.495）%与对照组（62.90±4.384）%相比P<0.05有统计学意义，PD98,059组G1期细胞比例为（57.40±7.640）%与E_2组相比P<0.05有统计学意义，SP600125组G1期细胞比例为（53.95±1.344）%与E_2组相比P0.05没有统计学意义，上述结果与各组S期比较结果一致。（5）Traswell迁移实验：对照组下层细胞数为22.80±8.643；E-82在浓度为1×10~(-8)mol/L时下层细胞数为65.20±12.617，与对照组比较有显著性增加（P0.05）。结论：（1）雌激素可以促进内皮祖细胞的增殖和迁移。（2）雌激素促进内皮祖细胞的增殖和迁移可能与ERK、JNK亚通路有关，阻断这两条通路可抑制此种作用；在正常细胞模型中阻断p38通路不能减弱雌激素促进内皮祖细胞增殖和迁移的作用。
研究背景
而且 冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)已经成为威胁人类健康的第三位杀手,也是严重影响人们生活质量的最常见的心血管疾病之一。研究表明冠心病是慢性炎症反应,动脉粥样斑块内有大量的单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和T淋巴细胞等炎症细胞的浸润,斑块内炎症反应非常活跃；而活动性炎症反应可促使稳定性粥样斑块转变为不稳定性斑块,这是冠状动脉内急性血栓形成的诱因。由此可见,抑制炎症细胞活性,阻断炎症反应通路已成为研究冠心病免疫治疗的热点和难点。众所周知,T淋巴细胞的激活是炎症反应的中心环节,而近年来发现的负性刺激信号(PD-1/PD-L1)对调节T淋巴细胞活性起重要作用。
程序性死亡因子配体1(programmed cell death ligand1, PD-L1、B7-H1或CD274)是由290个氨基酸构成的Ⅰ型跨膜蛋白。早在1999年Dong等研究指出PD-L1是B7家族分子的第三位成员,它的受体既不是CD28蛋白,也不是CTLA-4蛋白(cytotoxic T-lymphocyte Antigen4, CTLA-4)和ICOS蛋白(inducible co-stimulator, ICOS),其受体为程序性死亡因子1(programmed cell death1receptor, PD-1或CD279)。由于最初在肿瘤细胞中发现PD-L1有高表达,人们因此推测PD-L1可能与肿瘤细胞浸润有关；但随着研究深入,发现除肿瘤细胞以外,PD-Ll在多种炎症细胞和组织细胞上均有表达,如T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞、Kupffer细胞、星形细胞、树突状细胞、血管内皮细胞、骨髓源性肥大细胞、胎盘合体滋养层细胞等等；PD-L1的功能除与肿瘤细胞浸润以外,还与多种疾病发生有密切的关系,如移植免疫反应、自身免疫性疾病、微生物感染(病毒感染)。近年来研究还发现PD-L1/PD-1与动脉粥样斑块形成有关。Gotsman等研究冠状动脉斑块时,发现用荧光免疫技术可以探测到PD-L1可表达于多处动脉粥样斑块内。Lee等发现冠心病患者外周血T淋巴细胞PD-1表型及树突状细胞PD-L1表型均较健康人的明显降低,而冠心病患者树突状细胞激活初始T淋巴细胞能力明显增强。虽然现在对PD-L1的功能有了一定了解,然而到现在促使细胞表达PD-L1蛋白的分子机制还没有完全清晰。不同研究对象及使用不同刺激物,得出结果不完全相同,归纳起来影响PD-L1表达的细胞信号通路可能为JAK/STAT信号通路、PI3K/Akt信号通路、MEK/Erk信号通路.NPM/ALK通路,以及与IRF-1和STAT-3转录因子有关。众所周知,p38MAPK信号通路是MAPK通路的重要分支,它通过使转录因子磷酸化而改变基因的表达,参与多种细胞内信息传递过程,能对广泛的细胞外信号发生反应,介导细胞生长、发育、分化及死亡全过程。然而关于PD-L1蛋白表达与p38MAPK信号通路的关系的研究资料甚少。
PD173074分子量 什么 鉴于以上证据,本课题以体外培养单核细胞源树突状细胞作为研究对象,利用炎症因子(LPS)刺激树突状细胞模拟病原微生物入侵的模型,观察树突状细胞PD-L1表型的变化；再以p38蛋白特异性抑制剂SB203580阻断p38MAPK通路,探讨树突状细胞表达PD-L1与p38MAPK信号通路的关系,阐明LPS诱导树突状细胞表达PD-L1蛋白的分子机制,完善负性协同刺激信号(PD-1/PD-L)调控T淋巴细胞活性的机理,为动脉粥样硬化的免疫治疗的提供理论基础。 第一部分脂多糖诱导单核细胞源树突状细胞表达PD-L1 目的观察炎症因子(LPS)对树突状细胞CD80、CD86和PD-L1表型的影响,以明确LPS能够促进树突状细胞成熟,增强PD-Ll表达的作用。 对象和方法 1、对象体外培养健康人外周血单核细胞来源的树突状细胞 2、方法 2、1单核细胞的分离和培养 采用密度离心法分离健康人外周血单个核细胞,加入含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100μ g/ml链霉素的RPMI-1640培养基,调整细胞密度为5×106/ml,接种于六孔细胞培养板中,置入饱和湿度、5%CO237℃的细胞孵育箱中培养2小时。取出六孔细胞培养板,吸弃悬浮细胞,即得贴壁的单核细胞。 2、2树突状细胞的诱导和培养 贴壁的单核细胞用无Ca2+、Mg2+的PBS轻柔洗2次后,在每个孔加入含rhGM-CSF25ng/ml、rhIL-425ng/ml、100U/ml青霉素和100μ g/ml链霉素的树突状细胞完全培养基约3ml,置于5%CO237℃的孵育箱中继续培养,分别于第3、5天半量换液,补充细胞因子,维持rhGM-CSF和rhIL-4均为25ng/ml。于第7天收获树突状细胞。 2、3实验分组(每组设2个复孔,共实验4次)LPS用二甲基亚砜(DMSO)溶解。 根据使用是否使用脂多糖,将实验分为两组：LPS组(LPS)和对照组(NORMAL)。LPS组：树突状细胞给予LPS(1.0μ g/ml)处理后继续培养24小时；对照组：树突状细胞给予DMSO(0.1%V/V)处理后继续培养24小时。 2、4流式细胞术检测细胞表型 收集各组树突状细胞,调整细胞浓度为5×105/ml,分别加入相关表型抗体,孵育,清洗2次,用流式细胞仪检测相关表型荧光强度,用Cellquest分析检测结果。 3、统计学方法： 所有数据采用SPSS13.0软件处理,计量数据以均数±标准差(x±S)表示,统计学分析采用两独立样本t检验,P<0.