6 ABL抑制PDGF诱导的ERK1/2信号通路的激活 免疫共沉淀分析结果显示,ABL(5、10、20μM)可剂量依赖性地抑制PDGF(20 ng/ml)诱导的PDGF受体(PDGFR)的磷酸化,对PDGFR下游的MEK1/2、ERK1/2的激活分析显示,增加的MEK1/2和ERK1/2的磷酸化水平也随着ABL浓度的增加而逐渐降低。通过转染持续激活的MEK1/2表达质粒pCMV-MEK1,发现强制活化的ERK1/2可部分逆转ABL处理所致的VSMC增殖抑制,提示抑制ERK1/2信号通路的活化是ABL抗VSMC增殖的重要环节。 1.7 ABL抑制球囊损伤诱导的新生内膜形成 为了确定ABL在体内的抗VSMC增殖活性,建立大鼠颈总动脉内皮球囊损伤模型。形态学分析显示,给予ABL(26 mg/kg/day)的大鼠,球囊损伤诱导的血管新生内膜的增生程度较单纯球囊损伤组明显减轻,其面积分别为0.05±0.02
mm2和0.15±0.04 mm2,两者比较具有显著性差异(P < 0.01)。对血管组织切片进行TUNEL染色发现,ABL组新生内膜中阳性染色细胞数目较球囊损伤组明显升高,提示ABL可诱导新生内膜细胞发生凋亡。 综上所述,ABL可以阻断PDGF激活的ERK1/2信号通路,从而阻滞VSMC细胞周期的进程,抑制细胞DNA的合成,诱导细胞凋亡,并且可以抑制大鼠颈总动脉球囊损伤模型中血管新生内膜的形成。 2 ABL与Celecoxib协同抑制环加氧酶-2(COX-2)的表达和乳腺癌细胞的生长 以往研究证实,ABL具有抑制COX-2表达和PGE2释放的作用,但是ABL在肿瘤治疗方面是否具有成药性尚不清楚。COX-2特异抑制剂Celecoxib在乳腺癌的治疗和预防方面的有效性已得到临床证实,但是由于其副作用多的缺点而限制了该药的应用。基于ABL和Celecoxib具有相似的作用靶点,本研究探讨了二者联用对乳腺癌细胞的抑制作用,并对其抗肿瘤活性和药理机制进行了评价。 selleck 抑制剂 2.1 ABL和Celecoxib协同抑制乳腺癌细胞的增殖 将处于对数生长期的乳腺癌细胞(MDA-MB-231,MDA-MB-468和MCF-7)接种于96孔板中,分别加入不同浓度的ABL(5、10、25、50、100、150μM)和Celecoxib(2.5、5、10、20、40μM)处理细胞48 selleck chemicals h后,用MTT法检测细胞增殖活力。结果显示,随着化合物浓度的增加,各种乳腺癌细胞增殖活力不断下降,呈剂量依赖性的特点。然而,在两种化合物共同作用于乳腺癌细胞后,ABL(50μM)与Celecoxib(5μM)就可以产生明显的抑制作用,且抑制强度均明显高于相同剂量的单一制剂处理组(P < 0.05)。用Calcusyn软件分析发现,ABL与Celecoxib联用CI值< 0.05)。而在COX-2低表达的MDA-MB-468和MCF-7细胞中,两种化合物联用对凋亡的影响不明显。此外,通过Western blot检测发现,两种制剂联用能够显著激活MDA-MB-231细胞中的Caspase-3与Caspase-9,从而促进细胞凋亡的发生。
2.3 ABL和Celecoxib协同抑制乳腺癌细胞COX-2表达和活性 为了进一步探讨ABL与Celecoxib协同作用促进高表达COX-2的MDA-MB-231乳腺癌细胞凋亡的作用机制,进而检测了ABL和Celecoxib对COX-2的表达和活性的影响。RT-PCR、Western blot和免疫荧光染色结果表明,在高表达COX-2的MDA-MB-231细胞中,ABL(50μM)与Celecoxib(5μM)的联用明显抑制COX-2的转录和表达,减少PGE2的分泌,抑制作用明显高于相同剂量的单化合物处理组;在COX-2低表达的MCF-7细胞中,ABL(50μM)与Celecoxib(5μM)的联用同样可以抑制TPA(0.1μM)诱导的COX-2的表达。 2.4 ABL和Celecoxib协同抑制乳腺癌细胞COX-2基因转录的分子机制 报告基因分析结果表明,在转染COX-2启动子报告基因的MCF-7细胞中,ABL(50μM)与Celecoxib(5μM)可以协同抑制TPA(0.1μM)诱导的COX-2报告基因转录活性(P GDC-0449化学结构 < 0.05)。染色质免疫沉淀(ChIP)和DNA蛋白亲和分析实验发现,ABL与Celecoxib的协同效应是通过抑制转录因子ATF-2、CREB-1和c-Fos的激活及其与COX-2基因启动子区的CRE和AP-1元件的结合从而下调COX-2基因的转录活性。 2.5 ABL和Celecoxib协同抑制乳腺癌细胞中Akt和p38信号通路的激活 Akt和MAPK信号通路在介导COX-2基因的转录激活中发挥重要作用。在MCF-7细胞中,ABL(50μM)与Celecoxib(5μM)可以协同抑制TPA(0.1μM)诱导的Akt和p38信号通路的激活,而对JNK和ERK途径的影响不明显。将Akt表达质粒Ca-Akt和p38表达质粒MKK6b分别转染MCF-7细胞,均可以部分消除ABL与Celecoxib对COX-2的报告基因活性的协同抑制效应,转录因子活性分析也得到相似的结果。
综上所述,在细胞和整体水平上,ABL可以通过抑制乳腺癌细胞COX-2的表达和激活从而协同增强Celecoxib的抗肿瘤效应,为两者的联用提供实验依据。 3 ABL衍生物ABL-N通过激活JNK信号通路促进乳腺癌细胞凋亡 以往研究表明,ABL抑制肿瘤生长和诱导细胞凋亡的作用较弱,为了提高ABL的效力和成药性,对ABL的6-OH进行修饰,筛选得到ABL-N。活性分析显示,ABL-N对多种肿瘤细胞株的增殖具有很强的抑制效应。在前期研究的基础上,本部分重点观察了ABL-N对体外培养的人乳腺癌细胞增殖、凋亡的影响,并且通过体内实验对ABL-N的抗瘤活性进行了评价。 3.1 ABL-N抑制肿瘤细胞的增殖 将多种组织来源的肿瘤细胞株( MCF-7、MDA-MB-468、MDA-MB-231、Du145、PC-3、LoVo和HT-29)接种于96孔板中,分别加入不同浓度ABL-N(5、10、20、40μM)处理细胞1、3、6、12、24 h后,用MTT法检测各种细胞的增殖活力。结果显示,随着ABL-N浓度的增加和作用时间的延长,各种肿瘤细胞株增殖活力逐渐下降,提示ABL-N具有较广的抗肿瘤谱,其抗肿瘤增殖作用具有剂量和时间依赖性。 3.2 ABL-N阻滞乳腺癌细胞周期进程 用流式细胞仪检测细胞周期分布结果显示,ABL-N(20μM)作用于乳腺癌细胞(MDA-MB-231,MDA-MB-468和MCF-7)6、12、24 h后,可使处于G2/M期的细胞数明显增加,提示ABL-N可能是通过抑制细胞周期进程,使细胞停滞于G2/M期从而抑制细胞的增殖。 3.