CHIR99021和白血病抑制因子(leukaemia inhibitory factor,LIF)共同作用可以维持小鼠J1 ES细胞的细胞形态,并且上调小鼠J1 ES细胞标志基因的表达。终浓度为3μM的CHIR99021处理小鼠J1 ES细胞,并用等体积的DMSO处理的ES细胞作为对照。碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)染色结果表明,CHIR99021处理的小鼠J1
ES细胞表现出更高水平的碱性磷酸酶活性。免疫荧光染色(immunofluorescent Staining)结果表明CHIR99021可以上调Nanog的表达。免疫荧光染色和蛋白免疫印迹(immunoblotting)结果显示,CHIR99021处理的细胞,β-catenin表达显著增强,双荧光素酶报告分析系统(dual-luciferase 因为 reporter assay system)结果表明CHIR99021处理后小鼠ES细胞中的Wnt通路活性增强。3.对CHIR99021处理后的小鼠J1 ES细胞进行表达谱芯片分析,寻找差异表达基因,进一步揭示CHIR99021维持ES细胞干性的机制。芯片数据证明,CHIR99021能够显著上调干性相关基因的表达,同时也能下调分化相关转录因子的表达。利用DAVID(Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery)在线软件对筛选出的差异表达基因进行GO(Gene Ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分析,发现CHIR99021不仅能通过Wnt/β-catenin通路,同时也能通过其它通路如TGF-β和BMP等来促进小鼠J1 ES细胞的自我更新和多能性维持。4.CHIR99021通过抑制Nodal通路和促进Bmp4表达来增强BMP通路。定量PCR分析CHIR99021和SB431542(简称SB)处理及对照细胞中的Nodal,Smad7,BMP4及下游调控基因Lefty1,Lefty2和Ids的表达变化。结果表明,Nodal通路相关的基因表达下调,而BMP通路相关的基因表达上调。蛋白免疫印迹检测CHIR99021和SB431542处理及对照细胞中的Smad2和Smad1/5的磷酸化水平,结果与定量PCR结果一致。Dorsomorphin(Dorso)是BMP信号的小分子抑制剂,可阻断BMP介导的Smad1/5的磷酸化作用。CHIR99021和Dorso相关的实验结果表明,CHIR99021处理后细胞形态的维持需要BMP信号的活化。5.CHIR99021影响小鼠J1
ES细胞的表观遗传修饰。CHIR99021能够通过调控表观遗传相关基因,如Dnmt3l,Dnmt3a,Dnmt3b,Hdac9,Smarcal1和Cbx7的表达,改变ES细胞的表观遗传修饰。芯片和定量PCR结果表明,CHIR99021能下调Dnmt3l,Dnmt3a,Dnmt3b,Hdac9和Smarcal1的表达并上调Cbx7的表达。与转染NC-FAM的细胞相比,β-catenin敲降细胞中Dnmt3l的表达显著上调。据此推测,Dnmt3l可能是β-catenin的一个下游靶标。其他表观遗传调控基因可能不是β-catenin的下游靶标,但是可以被CHIR99021调节。综上所述,本研究表明小分子化合物CHIR99021可以通过调控蛋白编码基因的表达来促进小鼠J1
selleck抑制剂 ES细胞的自我更新和多能性维持,进一步揭示了CHIR99021促进小鼠ES细胞的自我更新的机制,并且为CHIR99021诱导多能性干细胞(iPS)重编程方面的研究提供了理论基础。
目的:本项目在前期研究工作的基础上,进一步探讨DADS下调TGF-β1介导的Wnt/β-catenin通路,抑制人胃癌MGC803细胞EMT及其分子机理,为寻找DADS抑制胃癌细胞迁移侵袭的作用靶点奠定理论基础。方法:人胃癌MGC803细胞分别分为未处理组、DADS处理组、外源性TGF-β1处理组、TGF-β1+TGF-β1抑制剂SB431542处理组、TGF-β1+DADS处理组、TGF-β1+Rac-1抑制剂NSC23766处理组,RT-PCR与Western 此网站 blot分别检测各组细胞TGF-β1、β-catenin、Rac-1、E-cadherin、Vimentin的表达。裸鼠成瘤实验观察各组移植瘤生长,免疫组织化学检测瘤体组织中Ki-67、CD34、E-cadherin、Vimentin的表达变化。结果:RT-PCR与Western blot显示,DADS可呈时间依赖性下调MGC803细胞TGF-β1、Rac-1、β-catenin、Vimentin m RNA及蛋白的表达和可呈时间依赖性上调E-cadherin m RNA及蛋白表达,以48h效果最佳(P<0.05)。裸鼠移植瘤实验显示,与未处理组相比,DADS处理组移植瘤生长速度与体积明显降低(P<0.05),TGF-β1处理组移植瘤生长速度与体积明显增加(P<0.05),加入DADS、SB431542、NSC23766可抑制TGF-β1对移植瘤生长速度与体积的促进作用(P<0.05)。免疫组化检查发现,与未处理组比较,DADS处理组瘤体的Ki-67、CD34、Vimentin蛋白阳性明显减少,E-cadherin蛋白阳性明显增多;相反,TGF-β1处理组的Ki-67、CD34、Vimentin蛋白阳性表达明显增强,而E-cadherin蛋白的阳性表达明显减弱。TGF-β1+SB431542、TGF-β1+DADS、TGF-β1+NSC23766较TGF-β1处理组Ki-67、CD34、Vimentin蛋白阳性明显降低及E-cadherin蛋白明显增加。结论:1.TGF-β1可促进MGC803细胞EMT与移植瘤生长;2.DADS可下调TGF-β1抑制MGC803细胞EMT与移植瘤生长;3.