MicroRNA-145通过TGF-β1信号通路促进了升主动脉瘤患者主动脉壁中层结构重塑目的：升主动脉壁中层结构重塑是升主动脉瘤患者主动脉壁的主要病理特征,但是,导致升主动脉瘤患者主动脉壁中层结构重塑的机制仍未完全阐明。有研究报道MicroRNA-145是新进发现的可调节平滑肌细胞寿命和可塑性的细胞因子。本研究将检测升主动脉瘤壁中MicroRNA-145的表达,并检测MicroRNA-145在升主动脉瘤患者主动脉壁中层结构发生重塑过程中的作用。方法：手术过程中获取10例因升主动脉瘤接受升主动脉置换术的患者的主动脉壁为病例组标本,对照组主动脉壁组织来自于因冠状动脉粥样硬化需进行冠状动脉搭桥手术的患者的升主动脉壁。研究过程中,应用H-E染色和Masson三色染色分别检测升主动脉壁形态学变化和升主动脉壁中胶原纤维的变化,应用实时定量反转录酶-聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测主动脉壁中microRNA-145的表达量,应用western
blot技术检测升主动脉壁中骨桥蛋白和Ⅲ型胶原蛋白的表达量。通过体外细胞培养,获取人体升主动脉壁平滑肌细胞,应用MicroRNA-145模拟物和抑制物外在干预升主动脉壁平滑肌细胞,观察MicroRNA-145的表达水平对升主动脉平滑肌细胞产生骨桥蛋白和Ⅲ型胶原蛋白作用的影响。然后应用MicroRNA-145模拟物和TGF-β1 siRNA共同作用于升主动脉壁平滑肌细胞,观察抑制TGF-β1的表达对MicroRNA-145促进升主动脉壁平滑肌细胞产生骨桥蛋白和Ⅲ型胶原蛋白作用的影响。结果：与正常对照组相比,升主动脉瘤患者主动脉壁中MicroRNA-145.骨桥蛋白和Ⅲ型胶原蛋白的表达明显增加(P
目的：以小鼠糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体相关蛋白配体(glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor-related protein ligand, 点击此处 mGITRL)作为共刺激分子在体外诱导Thl7细胞分化,研究参与该过程的信号分子,寻找其作用机制；建立小鼠胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis, CIA)模型,并用mGITRL蛋白进行处理,研究GITR/GITRL通路下游信号分子对CIA发病的影响,寻找其可能的作用机制。方法：(1)免疫磁珠法分离小鼠脾脏来源的CD4+CD62L+初始型T细胞,以1×106/孔的浓度将初始型T细胞在Th17细胞不完全诱导体系中培养,体系中含有预包板的抗CD3
selleck化学药品液面控制 mAb (1μg/ml),游离的TGF-β(3ng/ml)、IL-6 (30ng/ml)、IL-23 (30ng/ml).抗IL-4 mAb (5μg/ml)以及抗IFN γmAb (5μg/ml),再将mGITRL蛋白(1μg/ml)以及对照蛋白(1μg/ml)分别加入体系中,72h后通过流式细胞术检测Th17细胞的比例变化。(2)在小鼠初始型CD4+T细胞培养孔中加入抗CD3 mAb以及mGITRL蛋白,37℃、5%C02培养72小时,然后再加入不同浓度的mGITRL蛋白(0、0.5、1.0、2.0μg/ml)作用20mins>或者加入1.0μg/ml mGITRL蛋白作用不同时间(0、20、40、60mins),通过Western-Blot检测胞内p38 MAPK磷酸化水平。将1nGITRL蛋白、mGITRL蛋白+SB203580 (p38 MAPK抑制剂,5μM)以及mGITRL+DMSO(SB203580的溶剂)分别加入小鼠Th17细胞不完全诱导体系中(体系成分同上),培养72h,通过流式细胞术检测Th17细胞的比例变化,收集细胞培养上清,通过ELISA检测上清中IL-17A的水平。在小鼠Th17细胞不完全诱导体系中,加入mGITRL蛋白以及不同浓度的SB203580 (0、2.5、5、7.5、10μM),检测Th17细胞的比例、IL-17和RORγt mRNA的表达水平,培养上清中IL-17A的水平变化情况。将mGITRL蛋白、mGITRL蛋白+SB203580以及mGITRL+DMSO分别加入小鼠Th17细胞不完全诱导体系中(体系成分同上)培养72h后,通过qRT-PCR检测IL-21mRNA的表达水平变化；收集细胞培养上清,ELISA法检测上清中IL-21的水平变化。(3)在小鼠初始型CD4+T细胞培养孔中加入抗CD3
mAb以及mGITRL蛋白,37℃、5%CO2培养72小时,再经过不同浓度的mGITRL DNA Synthesis抑制剂 (0、0.5、1.0、2.0μg/ml)刺激相同时间(20mins),或经过相同浓度(1.0μg/ml)的]mGITRL蛋白处理不同时间(0、20、40、60 mins),然后通过Western-Blot检测胞内STAT3 Tyr705以及Ser727位点磷酸化水平；用SB203580 (p38 MAPK抑制剂)预处理活化的初始型T细胞不同时间(30、60、90mins)之后,再经过mGITRL蛋白刺激,通过Western-Blot检测胞内STAT3 Tyr705以及Ser727位点磷酸化水平。将mGITRL蛋白、mGITRL蛋白+Stattic (STAT3抑制剂)以及mGITRL+DMSO (Stattic的溶剂)分别加入小鼠Th17细胞不完全诱导体系中(同前),在Th17细胞诱导条件下培养72h,收集细胞培养上清,ELISA法检测上清中细胞因子IL-17A以及IL-21的水平变化；收集培养结束的细胞,通过qRT-PCR检测IL-21mRNA的表达水平。(4)将牛Ⅱ型胶原(CⅡ)与等体积的弗氏完全佐剂1：1混合,充分研磨直至混合物完全乳化,取乳化物(100μg CⅡ/只)于小鼠尾根部皮内注射。初次免疫当日为第0天,于初次免疫后第21天用C II与弗氏不完全佐剂的乳化物加强免疫,诱导小鼠胶原诱导性关节炎(CIA)模型。将小鼠随机分成三组：CIA-GITRL组、CIA-GITRL-SB203580组以及CIA-GITRL-Carrier (SB203580的溶剂)组(每组6只),在初次免疫后第22天给予CIA-GITRL组小鼠连续5天进行尾静脉注射mGITRL蛋白(20μg mGITRL蛋白溶于100μlPBS缓冲液中)；在初次免疫后第20天给予CIA-GITRL-SB203580组小鼠尾静脉注射SB203580 (2.