SAH条件下,大鼠脑细胞凋亡和血脑屏障破坏,行为学能力下降。2.普拉克索诱导的低体温可以有效地抑制SAH引起的脑细胞凋亡和血脑屏障破坏,有效改善行为学能力,发挥脑保护作用。3..复温抑制普拉克索的脑保护作用,进一步说明普拉克索通过诱导低体温发挥神经保护作用。4.SAH条件下,普拉克索通过诱导低体温抑制SAH引起的EBI。第三部分普拉克索诱导的低体温在蛛网膜下腔出血后发挥脑保护的作用机制目的:研究普拉克索诱导的药物性低温是否通过PI3K/AKT/GSK3β这一信号通路发挥保护作用。方法:将30只成年雄性SD大鼠随机分为SAH组(n=6)和SAH+普拉克索组(n=24);SAH+普拉克索组的24只大鼠又随机分为溶剂对照组,PI3K抑制剂LY294002组,AKT抑制剂MK-2206组以及GSK3β抑制剂CHIR99021组等4组,每组6只。各抑制剂与普拉克索同时进行腹腔注射。首先,通过western

很少 blot检测普拉克索处理对bcl-2的蛋白水平,caspase3活化以及PI3K/AKT/GSK3β通路的影响;其次,通过western blot检测各抑制剂在该动物模型中是否发挥作用;最后,通过western blot检测各组脑组织中白蛋白含量和活化的caspase3水平,以及通过TUNEL和FJB染色,行为学评分检测在PI3K/AKT/GSK3β这一通路被阻断的情况下,普拉克索诱导的低体温是否还能发挥脑保护作用。结果:1,在SAH条件下,普拉克索处理有效地上调了bcl-2的蛋白水平,抑制了caspase3的活化,激活了PI3K/AKT/GSK3β通路。2,在SAH条件下,LY294002可以有效地抑制PI3K,AKT和GSK3β的磷酸化;MK-2206可以有效地抑制AKT和GSK3β的磷酸化;CHIR99021可以有效地抑制GSK3β的磷酸化。3,在各阻断剂存在的情况下,普拉克索诱导的低体温不能有效地抑制SAH诱导的caspase3的活化,血脑屏障破坏,脑细胞凋亡和神经元坏死,行为能力丧失。结论:1.在SAH条件下,普拉克索有可能是通过激活了PI3K/AKT/GSK3β通路发挥神经保护作用。2.在SAH条件下,加入PI3K抑制剂LY294002可抑制下游蛋白AKT和GSK3β磷酸化,不能发挥神经保护作用。3.在SAH条件下,PI3K抑制剂LY294002,AKT抑制剂MK-2206以及GSK3β抑制剂CHIR99021均可抑制普拉克索诱导的药物性低温的脑保护作用。4.在SAH条件下,普拉克索至少部分的是通过PI3K/AKT/GSK3β通路发挥神经保护作用。
研究背景转移性乳腺癌约占乳腺癌的30-40%,恶性程度高,5年生存率低,是人类难治的恶性肿瘤之一。它病程进展迅速但常无明显的临床表现,难以早期发现因而错过根治的机会。这些患者在进展期往往只有少数患者可以接受手术治疗,而化疗是其主要的治疗手段。以紫杉类为主的治疗是转移性乳腺癌的一线治疗方案,特别是在对蒽环类耐药的情况下。临床试验证实单药多西他赛与丝裂霉素联合长春新碱相比可以明显提高总生存率,提高缓解率,延长疾病进展期。另外,尽管紫杉醇和多西他赛两种紫杉类药物均用与转移性乳腺癌的治疗,在总生存率及疾病进展时间上多西他赛获益更多。Albain等人发现吉西他滨与紫杉醇联合用药疗效优于紫杉醇单药治疗。在我们的研究中,通过体外培养乳腺癌细胞来研究短链神经酰胺与多西他赛联合作用对乳腺癌的治疗疗效。神经酰胺,主要存在与细胞膜结构中,是脂类家族的结构蛋白。作为信使分子,神经酰胺也能引起凋亡。许多研究表明:神经酰胺与肿瘤细胞的凋亡有关,增加内源性神经酰胺的产生可以诱发凋亡。可溶性的短链神经酰胺在许多肿瘤细胞株中表现出抗肿瘤作用,例如黑色素瘤,软组织肉瘤,Jurkat白血病,头颈部鳞状细胞癌。我们课题研究要点是神经酰胺是如何增加化疗制剂的疗效。我们的前期实验发现C6神经酰胺联合多西他赛可以增加多西他赛的抗乳腺癌疗效,并且发现C6神经酰胺联合多西他赛引起乳腺癌细胞大量凋亡,并与AMPK通路的活化有关。它涉及的分子机制有待进一步深入的研究。研究方法和材料人乳腺癌细胞MCF-7,MDA-231,均从上海生命科学研究所(上海,中国)购买,乳腺癌原代细胞取自外科手术中乳腺癌患者的肿瘤组织,各细胞在RPMI/DMEM培养基中(Simga公司,圣路易斯,密苏里州),加入10%的FBS(Sigma公司,圣路易斯,密苏里州),青霉素/链霉素(1:100,Sigma),培养37℃CO2培养箱中。细胞给予C6神经酰胺和多西他赛处理,显微镜下观察细胞形态,运用MTT方法检测细胞存活率,同时对细胞进行台盼蓝染色,计算活细胞率;运用Annexin

所以 还有 V试剂盒检测细胞凋亡,通过Western blot检测总的和磷酸化的AMPKα、ACC、信号水平的改变;运用程序性死亡抑制剂及凋亡抑制剂进一步验证C6神经酰胺和多西他赛诱导细胞死亡方式。建立AMPKα1-sh RNA及AMPK-α1显性失活(DN)突变(DN-AMPK-α1)c DNA稳转的肿瘤细胞,运用上述方法进一步验证信号通路的改变。为了了解线粒体通透性转换孔(m PTP)在协同用药对乳腺癌细胞的作用,通过JC-10染料测定细胞线粒体膜电位(MMP),FACS检测ROS生成,通过Western blot检测细胞色素C,C-caspase3,JNK,HER-1/2,Akt/Erk信号通路等,了解线粒体通路的改变,并通过MPTP抑制剂及ROS清除剂等方法来验证线粒体通路作用及相关信号通路改变。建立CYP-D-sh RNA稳转肿瘤,Cyp-D过表达乳腺癌细胞进一步验证C6神经酰胺和多西他赛诱导细胞死亡的信号通路改变。统计学处理在每个实验中,至少使用三个孔/平皿。每个实验重复至少三次,每次获得具有相似的结果。数据以均数±标准偏差(SD)。使用SPSS15.